脳浸潤白血球の分離
Summary
マウス脳から浸潤白血球を得るために迅速な方法が記載されている。この方法は連続Percoll勾配と白血球に富む層を選択し、精製する不連続フィコール勾配を利用しています。分離された白血球は、フローサイトメトリー測定によって特徴付けることができる。
Abstract
我々は、マウスからの脳浸潤白血球（BILs）を調製するための方法を説明します。我々はどのように脳全体から浸潤細胞の白血球に富む集団を精製するために迅速な頭蓋内注入法とを経由してタイラーのマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）をマウスに感染させる方法を示します。簡単に言えば、マウスは、密閉チャンバーのイソフルランで麻酔し、前頭皮質にハミルトンシリンジで注入フリーハンドです。マウスはその後Tenbroeck組織グラインダーを含むRPMIで抽出し、均質化されイソフルラン過剰摂取と全脳による感染後の様々な時点で殺されている。脳ホモジネートを、ミエリン及び他の細胞破片を除去するために、連続30％Percoll勾配を通じて遠心分離されています。細胞懸濁液を、40μmの時に緊張洗浄し、白血球を選択し、精製する不連続をFicoll – Paqueプラス勾配で遠心分離される。白血球を洗浄し、フローサイトメトリーで免疫表現するための適切な緩衝液に再懸濁する。フローサイトメトリーはC57BL / 6マウスにおける感染の初期段階での自然免疫細胞の集団を明らかにする。 24時間後に感染症で、免疫細胞の複数のサブセットにはGR1 +、CD11b +とF4/80 +細胞の濃縮の人口で、BILsに存在しています。したがって、この方法は、脳内の急性感染症に対する免疫応答を特徴づけるのに便利です。
Protocol
Discussion
我々は日常的に脳浸潤細胞調製物の品質の両方を決定するためにフローサイトメトリーを使用し、免疫細胞2,9の異なる集団を区別する。急性の時間の時点で、私たちのBILsメソッドはCD45hi集団内の炎症性単球と同様にCD45lo集団におけるマクロファージの高い割合の高い割合を得られます。これは、脳内で再現性の免疫応答が確実に私たちの方法によって特徴付けることができることを?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、メイヨークリニック（CLH）から初期のキャリア開発賞で、NINDS（CLH）から助成金NS64571でサポートされており、ドナルドとフランシスHerdrich（CLH）からの寛大な贈り物がされました。我々は援助のためのメイヨークリニックのフローサイトメトリーコアを感謝したいと思います。
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
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