Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos
Summary
Um método rápido para a obtenção de leucócitos infiltrando a partir do cérebro de camundongos é descrito. Este método utiliza um gradiente de Percoll contínua e descontínua gradiente de Ficoll para selecionar e purificar a camada de leucócitos enriquecido. Leucócitos isolados podem então ser caracterizada por medidas de citometria de fluxo.
Abstract
Nós descrevemos um método para preparar leucócitos cérebro infiltrando (Bils) de camundongos. Demonstramos como para infectar ratos com encefalomielite murina de Theiler vírus (TMEV) através de uma técnica de injeção intracraniana e rápida como purificar uma população de leucócitos enriquecido de células infiltrando a partir do cérebro inteiro. Resumidamente, os ratos são anestesiados com isoflurano em uma câmara fechada e são free-hand injetado com uma seringa de Hamilton para o córtex frontal. Ratos são, então, matou em vários momentos após a infecção por overdose isoflurano e cérebros inteiros são extraídos e homogeneizados em RPMI com um moedor de tecido Tenbroeck. Homogeneizados de cérebro são centrifugação em um gradiente de Percoll contínua de 30% para remover os restos celulares de mielina e outros. A suspensão de células é então forçada a 40 mM, lavado e centrifugado em um descontínua gradiente de Ficoll-Paque Plus para selecionar e purificar os leucócitos. Os leucócitos são então lavadas e ressuspendidas em tampão apropriado para imunofenotipagem por citometria de fluxo. Citometria de fluxo revela uma população de células do sistema imunológico inato nas fases iniciais da infecção de camundongos C57BL / 6. Menos 24 horas após a infecção, subconjuntos múltiplas de células do sistema imunológico estão presentes no Bils, com uma população enriquecida de Gr1 +, CD11b + e + F4/80 células. Portanto, esse método é útil na caracterização da resposta imune à infecção aguda no cérebro.
Protocol
Discussion
Rotineiramente uso de citometria de fluxo para determinar a qualidade da preparação das células cerebrais se infiltrando, e para distinguir diferentes populações de células do sistema imunológico 2, 9. Aguda em tempo de pontos, o nosso método Bils rendimentos elevados percentuais de monócitos inflamatória dentro da população CD45hi, bem como altas porcentagens de macrófagos na população CD45lo. Isto indica que uma resposta imune reprodutíveis dentro do cérebro pode ser robustamente caracteriz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por bolsa NS64571 do NINDS (CLH), por um prêmio no início de desenvolvimento de carreira da Clínica Mayo (CLH), e por um generoso dom de Donald e Herdrich Frances (CLH). Gostaríamos de agradecer a Clínica Mayo Núcleo Citometria de Fluxo para obter assistência.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. . B. r. o. w. n., , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
- Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
