Isolering av Brain-infiltrera leukocyter
Summary
En snabb metod för att få infiltrera leukocyter från mus hjärnan beskrivs. Denna metod använder en kontinuerlig Percoll lutning och diskontinuerliga Ficoll lutning för att välja och rena leukocyt-berikade lager. Isolerade leukocyter kan då präglas av flödescytometrisk mätningar.
Abstract
Vi beskriver en metod för att förbereda hjärnan infiltrera leukocyter (BILS) från möss. Vi visar hur du infektera möss med Theiler är murina encefalomyelit virus (TMEV) via en snabb intrakraniell injektionsteknik och hur man renar en leukocyt-berikad population av infiltrera celler från hela hjärnan. Kortfattat, möss är sövda med isofluran i en sluten kammare och är fri hand injiceras med en Hamilton sprutan i frontala cortex. Möss är sedan dödas vid olika tidpunkter efter infektion med isofluran överdos och hela hjärnor extraheras och homogeniseras i RPMI med en Tenbroeck vävnad kvarn. Brain homogenat centrifugeras genom en kontinuerlig 30% Percoll lutning för att ta bort myelinet och andra cell skräp. Cellsuspensionen sedan ansträngd vid 40 ìm, tvättas och centrifugeras för en diskontinuerlig Ficoll-Paque Plus lutning för att välja och rena leukocyter. Den leukocyter sedan tvättas och suspenderade i lämpliga buffertar för immunfenotypning med flödescytometri. Flödescytometri avslöjar en population av medfödda immunförsvaret celler i ett tidigt skede av infektionen i C57BL / 6 möss. 24 timmar efter infektion, flera delmängder av immunceller finns i BILS, med en berikad population av Gr1 +, CD11b + och F4/80 + celler. Därför är denna metod användbar i karakterisera immunsvaret mot akut infektion i hjärnan.
Protocol
Discussion
Vi använder rutinmässigt flödescytometri för att avgöra både kvaliteten av hjärnan infiltrera cellberedningen och för att skilja olika populationer av immunceller 2, 9. Vid akuta gånger, ger våra BILS metod hög andel av inflammatoriska monocyter inom CD45hi befolkningen samt hög andel av makrofager i CD45lo befolkningen. Detta tyder på att ett reproducerbart immunsvar i hjärnan kraftigt kan präglas av vår metod.
Denna teknik är av särskild betydelse för experime…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag NS64571 från NINDS (CLH), genom en tidig karriär utmärkelse från Mayo Clinic (CLH), och genom en generös gåva från Donald och Frances Herdrich (CLH). Vi vill tacka de Mayo Clinic Kärna flödescytometrisystem för hjälp.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. . B. r. o. w. n., , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
- Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
