Dans l'imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons
Summary
Un protocole minimalement invasive pour stabiliser la colonne vertébrale de souris et d'effectuer répétitives<em> In vivo</emImagerie> moelle épinière en utilisant microscopie à deux photons est décrit. Cette méthode combine un dispositif de stabilisation vertébrale et un régime d'anesthésie afin de minimiser les mouvements induits par des voies respiratoires et de produire des données d'imagerie brutes qui ne nécessitent pas d'alignement ou d'autres post-traitement.
Abstract
L'imagerie de vivo en utilisant microscopie à deux photons dans une souris qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer des protéines fluorescentes dans des types cellulaires 2-3 a sensiblement élargi notre connaissance des processus physiologiques et pathologiques dans de nombreux tissus in vivo 4-7. Dans les études sur le système nerveux central (SNC), il ya eu une large application de l'imagerie de vivo dans le cerveau, qui a produit une pléthore de nouvelles et les résultats souvent inattendus sur le comportement des cellules comme les neurones, les astrocytes, la microglie, sous conditions physiologiques ou pathologiques 8-17. Toutefois, des complications essentiellement techniques ont limité la mise en œuvre de l'imagerie de vivo dans des études de la moelle épinière de souris vivante. En particulier, la proximité anatomique de la moelle épinière vers les poumons et le cœur génère des artefacts importants mouvements qui permet l'imagerie de la moelle épinière qui vivent une tâche difficile. </p>
Nous avons développé une nouvelle méthode qui permet de surmonter les limitations inhérentes à l'imagerie de la moelle épinière par la stabilisation de la colonne vertébrale, réduisant respiratoires induites par les mouvements et en facilitant ainsi l'utilisation de la microscopie à deux photons à l'image de la moelle épinière de souris in vivo. Ce résultat est obtenu en combinant un dispositif de stabilisation spinale personnalisé avec une méthode d'anesthésie profonde, résultant en une réduction significative des maladies respiratoires induites par les mouvements. Ce protocole vidéo montre comment exposer une petite zone de la moelle épinière qui vivent peut être maintenu sous des conditions physiologiques stables sur de longues périodes de temps en gardant une lésion des tissus et des saignements au minimum. Représentant des images brutes acquises en détail in vivo à haute résolution de la relation étroite entre les microglies et la vascularisation. Une séquence timelapse montre le comportement dynamique des processus microgliales dans la moelle épinière de souris vivante. Par ailleurs, une analyse continue de la même z-cadre démontrents la stabilité exceptionnelle que cette méthode peut réaliser pour générer des piles d'images et / ou des films timelapse qui ne nécessitent pas d'alignement d'image post-acquisition. Enfin, nous montrons comment cette méthode peut être utilisée pour revisiter et réimager la même zone de la moelle épinière au timepoints plus tard, permettant des études longitudinales de cours de processus physiologiques ou pathologiques in vivo.
Protocol
Discussion
La méthode décrite ici permet de stable et répétitive en imagerie in vivo de la fluorescence densément peuplées structures cellulaires dans la moelle épinière des souris anesthésiées à l'aide microscopie à deux photons. La stabilité obtenue est le résultat d'un instrument fait sur mesure et une stabilisation de la colonne vertébrale protocole anesthésique qui réduit d'artefact mouvement respiratoire induite. Le dispositif de stabilisation vertébrale permet de répit sous l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Multiple Sclerosis Society accorde RG4595A1 / T à DD et les subventions des NIH / NINDS NS051470, NS052189 et NS066361 aux figures KA et des films adaptés et / ou tiré à part de Davalos et coll., J Neurosci Méthodes. Mars 2008 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, avec la permission d'Elsevier.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bionichepharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd Labs | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment |
Phoenix pharmaceutical |
NDC No: 57319-760- 25 |
Lubricant |
| Betadine | Fisher | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors |
World Precision Instruments |
555500S | Curved, blunt-tip scissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments |
555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia,Pfizer Inc. | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps |
Narishige | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham Biosciences Corp. |
80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Healthcare | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. |
NDC No: 12496- 6757-1 |
Buprenorphine, injectable |
| Baytril | Bayer | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad – Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
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