In vivo Imaging av Mouse Spinal Cord Bruke to-foton Mikroskopi
Summary
Et minimalt invasive protokoll for å stabilisere musen ryggsøylen og utføre repetitive<em> In vivo</em> Ryggmargen avbildning ved hjelp av to-foton mikroskopi er beskrevet. Denne metoden kombinerer en spinal stabilisering enhet og en bedøvende diett for å redusere respiratoriske-induserte bevegelser og produsere rå imaging data som krever ingen justering eller annen etterbehandling.
Abstract
In vivo avbildning ved hjelp av to-foton mikroskopi 1 i mus som er genmodifisert til å uttrykke fluorescerende proteiner i bestemte celletyper 2-3 har betydelig utvidet vår kunnskap om fysiologiske og patologiske prosesser i en rekke vev in vivo 4-7. I studier av sentralnervesystemet (CNS), har det vært en bred anvendelse av in vivo avbildning i hjernen, som har produsert en mengde nye og ofte uventede funn om oppførselen til cellene som nevroner, astrocytes, microglia, under fysiologiske eller patologiske tilstander 8-17. Imidlertid har det meste tekniske komplikasjoner begrenset gjennomføringen av in vivo avbildning i studier av levende mus ryggmargen. Spesielt genererer anatomiske nærhet av ryggmargen til lungene og hjertet vesentlig bevegelse gjenstand som gjør bildebehandling levende ryggmargen en utfordrende oppgave. </p>
Vi utviklet en ny metode som overvinner de iboende begrensningene i ryggmargen bildebehandling ved å stabilisere ryggsøylen, redusere respiratoriske-induserte bevegelser og dermed legge til rette for bruk av to-foton mikroskopi til bildet musen ryggmarg in vivo. Dette oppnås ved å kombinere et tilpasset spinal stabilisering enheten med en metode for dyp anestesi, noe som resulterer i en betydelig reduksjon av respiratorisk-indusert bevegelser. Denne videoen protokoll viser hvordan å eksponere et lite område av den levende ryggmargen som kan opprettholdes under stabile fysiologiske forhold over lengre tid ved å holde vev skade og blødning til et minimum. Representant rå bilder ervervet in vivo detalj i høy oppløsning det nære forholdet mellom microglia og blodkar. En timelapse sekvens viser den dynamiske oppførselen til microglial prosesser i levende mus ryggmargen. Dessuten en kontinuerlig skanning av samme z-frame demonstrereer den enestående stabiliteten at denne metoden kan oppnå å generere stabler av bilder og / eller timelapse filmer som ikke krever bildejusteringen etter oppkjøpet. Til slutt viser vi hvordan denne metoden kan brukes til å besøke og Reimage samme område i ryggmargen på senere tidspunkter, slik at for longitudinelle studier av pågående fysiologiske eller patologiske prosesser in vivo.
Protocol
Discussion
Metoden er beskrevet her gir stabil og repeterende in vivo avbildning av tettbefolkede fluorescerende cellulære strukturer i ryggmargen av bedøvet mus ved hjelp av to-foton mikroskopi. Den oppnådde stabilitet er et resultat av en skreddersydd spinal stabilisering enheten og en bedøvende regime som reduserer respiratorisk-indusert bevegelse gjenstand. Den spinal stabilisering enheten kan pusterom under musen kroppen og kan bygges ved hjelp av kommersielt tilgjengelige spinal klemmer og hode montering stykke …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Multiple Sclerosis Society stipend RG4595A1 / T til DD og NIH / NINDS stipend NS051470, NS052189 og NS066361 til KA Tall og filmer tilpasset og / eller gjengitt fra Davalos et al., J Neurosci metoder. 2008 Mar 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, med tillatelse fra Elsevier.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bionichepharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd Labs | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment |
Phoenix pharmaceutical |
NDC No: 57319-760- 25 |
Lubricant |
| Betadine | Fisher | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors |
World Precision Instruments |
555500S | Curved, blunt-tip scissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments |
555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia,Pfizer Inc. | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps |
Narishige | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham Biosciences Corp. |
80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Healthcare | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. |
NDC No: 12496- 6757-1 |
Buprenorphine, injectable |
| Baytril | Bayer | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad – Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer’s disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer’s disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
- Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
- Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
- Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
- Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).
