मध्य प्रमस्तिष्क धमनी आड़ के माउस मॉडल

Summary

हम वीडियो में एक मध्यम वयस्क एक intraluminal monofilament का उपयोग चूहों में मस्तिष्क धमनी रोड़ा के उत्पादन के लिए एक विधि का प्रदर्शन. हम यह भी बताएंगे कि कैसे 2,3,5 triphenyltetrazolium क्लोराइड धुंधला (टीटीसी) के द्वारा मस्तिष्क रोधगलन की हद तक का मूल्यांकन करने के लिए.

Abstract

स्ट्रोक सबसे आम संयुक्त राज्य अमेरिका में ¹ घातक स्नायविक रोग है. मस्तिष्क में रक्त वाहिकाओं की रुकावट (ischemic स्ट्रोक) ² से स्ट्रोक का बहुमत (88%) का परिणाम है. के बाद से सबसे ischemic स्ट्रोक (~ 80%) मध्य मस्तिष्क (एमसीए) धमनी ³ के राज्यक्षेत्र में होते हैं, कई जानवर स्ट्रोक मॉडल विकसित किया गया है कि इस धमनी पर ध्यान केंद्रित किया है . मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) के intraluminal monofilament मॉडल बाह्य मन्या धमनी में एक शल्य चिकित्सा फिलामेंट की प्रविष्टि शामिल है और इसे आगे आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए) में जब तक टिप एमसीए के मूल occludes सूत्रण, जिसके परिणामस्वरूप एक समाप्ति में रक्त प्रवाह और एमसीए क्षेत्र ⁴ में बाद मस्तिष्क रोधगलन. तकनीक स्थायी या क्षणिक ⁵ रोड़ा मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अगर सीवन एक निश्चित अंतराल (30 मिनट, 1 घंटे या 2 घंटे) के बाद हटा दिया जाता है, reperfusion (क्षणिक MCAO) हासिल की है, अगर रेशा जगह में छोड़ दिया है (24 घंटे) प्रक्रिया स्थायी MCAO की एक मॉडल के रूप में उपयुक्त है . इस तकनीक craniectomy, खोपड़ी के एक हिस्से है, जो intracranial दबाव और ^{तापमान} छह प्रभावित कर सकता है निकालने के लिए एक neurosurgical प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं है. यह सबसे अक्सर इस्तेमाल किया विधि करने के लिए चूहों ^और चूहों 7,8 में स्थायी और क्षणिक फोकल मस्तिष्क ischemia नकल बन गया है. मस्तिष्क रोधगलन की हद तक का मूल्यांकन करने के लिए, हम 2,3,5 triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) के साथ ^{मस्तिष्क} स्लाइसें दाग ischemic मस्तिष्क ऊतक 9 की पहचान. इस वीडियो में, हम MCAO विधि और टीटीसी धुंधला द्वारा रोधगलितांश आकार का निर्धारण प्रदर्शित करता है.

Protocol

1. MCAO विधि इस प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और UCSF और केंट स्टेट विश्वविद्यालय में उपयोग समितियों, और उपयोग के लिए प्रायोगिक पशुओं के स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा abides द्वारा अनुमोदित किया गया था. 20 मिमी क्षेत्रों में 5-0 monofilament सिवनी (हार्वर्ड उपकरण, Holliston, एमए) काटें. यह एक cauterizer (Braintree वैज्ञानिक, Inc, Braintree, MA) के पास हीटिंग द्वारा प्रत्येक खंड की नोक दौर. एक micrometer (एप्लाइड छवि इंक, Rochester, NY) का उपयोग टिप के व्यास उपाय. हम 25-30 जी के शरीर के वजन के साथ एक माउस के लिए एक 0.21-0.22 मिमी के अंतिम टिप व्यास के साथ एक सिवनी उपयोग Autoclaving (कम से कम 121 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 15, साई) द्वारा सभी शल्य चिकित्सा उपकरण जीवाणुरहित सर्जरी मेज और संबद्ध उपकरण 70% इथेनॉल का उपयोग sanitize. के साथ एक 8-12 सप्ताह पुराने माउस (25-30 ग्राम) anesthetize 5% (Aerrane, बैक्सटर, Deerfield, आईएल) isoflurane 70% 30% 2 हे / N 2 हे वी-10 संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग (VetEquip, इंक , Pleasanton, CA). संज्ञाहरण के अधिष्ठापन के बाद, isoflurane के स्तर को कम करने और यह 1.5% पर बनाए रखने के. ढालुआं स्थिति में एक हीटिंग पैड पर माउस रखें. एक गुदा जांच सम्मिलित करें, और निगरानी और 36.5-37.5 के बीच शरीर का तापमान ° का उपयोग सी TR-200 homeothermic तापमान प्रणाली (ललित विज्ञान उपकरण इंक, फोस्टर शहर, सीए). बनाए रखने बिजली कतरनी (Braintree वैज्ञानिक) के लिए त्वचा बेनकाब के साथ उदर गर्दन क्षेत्र पर फर दाढ़ी. शल्य चिकित्सा 70% इथेनॉल के तीन अनुप्रयोगों का उपयोग कर साइट कीटाणुरहित. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत विदारक (Nikon, जापान), गर्दन पर 1 सेमी लंबे midline चीरा. शल्य चिकित्सा क्षेत्र का पर्दाफाश करने के लिए और सही आम मन्या (सीसीए) धमनी, बाह्य मन्या धमनी (ईसीए), और आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए) की पहचान retractors (Braintree वैज्ञानिक) का प्रयोग करें. सावधानी से आसपास के नसों और प्रावरणी से मुक्त धमनियों काटना. ईसीए आगे distally काटना और ईसीए और इसके बेहतर थाइरोइड धमनी (एसटीए) एक द्विध्रुवी coagulator (हावर्ड साधन इंक, Tuscaloosa, AL) का उपयोग शाखा जमना. Coagulated खंड में ईसीए और जाँच कट. शिथिल ईसीए स्टंप के आसपास दो 8-0 रेशम sutures के टाई. ईसीए और आईसीए में सीसीए के बंटवारे पर एक संवहनी क्लैंप (ललित विज्ञान उपकरण) लागू करें. Vannas शैली वसंत कैंची (ललित विज्ञान उपकरण) के साथ एक ईसीए स्टंप के अंत में एक छोटा सा चीरा करें. उपाय और एक 5-0 monofilament नोक पर गोल सीवन की लंबाई रिकॉर्ड. चीरा में सिवनी डालें और क्लैंप करने के लिए अग्रिम. लुमेन के आसपास दो रेशम sutures सिर्फ सुरक्षित अभी तक में रहने वाली monofilament सीवन की गतिशीलता बनाए रखने के लिए पर्याप्त कसो. विभाजन से दबाना निकालें. धीरे ईसीए के लुमेन से आईसीए में monofilament सीवन सीसीए के बंटवारे को एमसीए के मूल रोक देना परे 9-10 मिमी की दूरी के लिए अग्रिम. सर्जरी की अवधि 30-45 मिनट के बारे में है. गर्दन पर चीरा सिवनी और एक 35 डिग्री सेल्सियस नर्सिंग संज्ञाहरण से उबरने के लिए, और यह पिंजरे पर लौटने बॉक्स में माउस जगह. यह आम तौर पर चूहों के लिए संज्ञाहरण से उबरने के लिए 5-10 मिनट लगते हैं. क्षणिक MCAO प्रदर्शन करने के लिए, शोधकर्ता माउस फिर anesthetize कर सकते हैं और सिवनी समय की अवधि के बाद वापस ईसीए के स्टंप में वापस लेने, आम तौर पर बीच 0.5-2 एच. MCAO के अधिष्ठापन के बाद चौबीस घंटे, isoflurane 5% के साथ माउस anesthetize और यह गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था द्वारा euthanize. माउस सिर काटना और मस्तिष्क इकट्ठा. चार बर्फ पर एक मस्तिष्क मैट्रिक्स (Braintree वैज्ञानिक) के साथ 2 मिमी स्लाइस में मस्तिष्क coronally स्लाइस. 2% में मस्तिष्क 2,3,5 triphenyltetrazolium (टीटीसी) 1X पीबीएस में क्लोराइड (सिग्मा Aldrich) कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए और infarction के आकार की सीमा निर्धारित स्लाइस सेते हैं. इमेजिंग जब तक 10% में मस्तिष्क स्लाइसें ° 4 में तटस्थ formalin समाधान (सिग्मा Aldrich) buffered सी तय करो. रोधगलन की हद तक के रूप जौव 955 प्रोटोकॉल (में वर्णित मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9. 2. प्रतिनिधि परिणाम MCAO द्वारा उत्पन्न दौरे striatum और dorsolateral प्रांतस्था में देखा जाता है. striatum प्रमस्तिष्क प्रांतस्था से अधिक ischemia के प्रति संवेदनशील है. MCAO के तीस मिनट striatum में केवल एक रोधगलितांश उत्पादन, जबकि MCAO के एक घंटे से अधिक दोनों striatum और प्रांतस्था नुकसान होगा. 24 घंटे स्थायी MCAO के बाद, कुल रोधगलितांश प्रतिशत 40 ~ ± गोलार्द्ध और सर्जरी के बाद मृत्यु दर के 5% ~ 10% है. हम आगे के अध्ययन से चूहों के बाहर है अगर सर्जरी के दौरान अत्यधिक रक्तस्राव होता है, आपरेशन के समय 90 मिनट से अधिक है, चूहों के लिए 15 मिनट के भीतर संज्ञाहरण से उबरने में विफल है, या रक्तस्राव मस्तिष्क स्लाइसें में या शवपरीक्षा परीक्षा के दौरान विलिस के चक्र के आधार पर पाया जाता है . 61/2761fig1.jpg "Alt =" 1 / चित्रा "> चित्रा 1. टीटीसी से सना हुआ मस्तिष्क स्लाइसें के प्रतिनिधि स्थायी MCAO के 24 घंटे के बाद (राज्याभिषेक 1-4 स्तर) छवियों . में रहने वाले ऊतक टीटीसी enzymatically (TPF) 1,3,5 triphenylformazan, जो लाल रंग में है dehydrogenases द्वारा कम है, जबकि परिगलित क्षेत्रों में यह सफेद रहता है ऐसे enzymatic गतिविधि के अभाव के कारण. इसलिए, infarction के क्षेत्र में अपनी सफेद टीटीसी के TPF के लिए रूपांतरण की कमी के कारण रंग द्वारा पहचाना जा सकता है. नोट: टीटीसी कुछ हद तक गर्मी और प्रकाश अस्थिर इतनी गर्मी और जितना संभव के रूप में में प्रकाश से सना हुआ वर्गों की रक्षा है.

Discussion

चूहों में MCAO सामान्यतः मानव में फोकल मस्तिष्क ischemia मॉडल प्रयोग किया जाता है. स्ट्रोक के अध्ययन के लिए चूहों का प्रयोग अधिक अक्सर ट्रांसजेनिक और पीटा उपभेदों की उपलब्धता की वजह बन गया है. वहाँ कुछ महत्वपूर्ण विवरण प्रोटोकॉल में नोट कर रहे हैं:

1. यह आवश्यक है करने के लिए सर्जरी के दौरान माउस शरीर का तापमान बनाए रखने और इससे पहले कि यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से ठीक है. शारीरिक तापमान infarction के हद पर प्रभाव है, हाइपोथर्मिया घट जाती है और अतिताप रोधगलितांश का आकार बढ़ता है.
2. जबकि उजागर और सीसीए और ईसीए अलग पास vagus नसों और ट्रेकिआ है, जो रोधगलितांश आकार और कमी व्यवहार्यता बढ़ाया जा सकता है हानिकारक से बचने के.
3. कभी monofilament सिवनी 10 मिमी से अधिक विभाजन से गुजारें सम्मिलित करें. एक बहुत दूर सम्मिलित सीवन के पूर्वकाल मस्तिष्क और मस्तिष्क रक्तस्राव में धमनी परिणाम छेदना कर सकते हैं. एक प्रतिरोध महसूस हो सकता है जब सीवन विभाजन बिंदु से आगे 9-10 मिमी के बारे में उन्नत है. यदि ऐसा होता है, शोधकर्ता सीवन अग्रिम बंद करो और दूरी की पुष्टि करनी चाहिए.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Isoflurane	Chemical	Aerrane, Baxter	95045-588
V-10 Anesthesia system	Equipment	VetEquip	901807
TR-200 Temp Controller	Equipment	Fine Science Tools	21060
Electric clipper	Equipment	Braintree	CLP-9931
Dissecting microscope	Equipment	Nikon	SMZ745T
Retractor system	Equipment	Braintree	ACD-014
Bipolar coagulator	Equipment	Howard Instrument	64000
Silk suture	Material	Harvard Apparatus	510479
Monofilament suture	Material	Harvard Apparatus	723351
Vascular clamp	Equipment	Fine Science Tools	00396-01
Vannas scissor	Equipment	Fine Science Tools	15000-08
Brain matrix	Equipment	Braintree	BS-2000C
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma-Aldrich	T8877
10% neutral buffer formalin	Chemical	Sigma-Aldrich	HT5011