Modello murino di Mezzo occlusione dell'arteria cerebrale

Summary

Dimostriamo nel video un metodo per produrre una occlusione dell'arteria cerebrale media in topi adulti utilizzando un monofilamento intraluminale. Mostriamo anche come valutare il grado di infarto cerebrale da 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione.

Abstract

L'ictus è la più comune malattia neurologica letale negli Stati Uniti ^1. La maggior parte degli ictus (88%) il risultato di ostruzione dei vasi sanguigni nel cervello (ictus ischemico) ^2. Poiché la maggior parte ictus ischemici (~ 80%) si verificano nel territorio dell'arteria cerebrale media (MCA) ^3, molti modelli animali ictus che sono stati sviluppati si sono concentrati su questa arteria. Il modello di monofilo intraluminale di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) prevede l'inserimento di un filamento chirurgico nella carotide esterna e filettatura in avanti in arteria carotide interna (ICA) finché la punta occlude l'origine della MCA, con conseguente cessazione del flusso sanguigno e conseguente infarto cerebrale nei ⁴ territorio MCA. La tecnica può essere usata per modellare permanente o transitoria occlusione ^5. Se la sutura viene rimosso dopo un certo intervallo (30 min, 1 h, o 2 h), la riperfusione è raggiunto (transitoria MCAO), se il filamento viene lasciato in sede (24 ore) la procedura è adatta come un modello di permanente MCAO . Questa tecnica non richiede craniectomia, una procedura di neurochirurgia per rimuovere una porzione di cranio, che possono influenzare la pressione intracranica e della temperatura ^6. E 'diventato il metodo più frequentemente usato per mimare permanente e transitoria ischemia cerebrale focale in ratti e topi ^7,8. Per valutare il grado di infarto cerebrale, si macchia sezioni di cervello con 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) per identificare il tessuto ischemico cerebrale ^9. In questo video, dimostriamo il metodo MCAO e la determinazione della dimensione dell'infarto da colorazione TTC.

Protocol

1. Metodo MCAO Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e dei Comitati Istituzionali Usa a UCSF e Kent State University, e si attiene alle linee guida dell'Istituto Nazionale di Sanità per l'uso di animali da esperimento. Tagliare una sutura monofilamento 5-0 (Harvard Apparatus, Holliston, MA) in 20 segmenti mm. Intorno alla punta di ogni segmento di riscaldamento vicino a una cauterizer (Braintree Scientific, Inc., Boston, MA). Misurare il diametro della punta con un micrometro (Applied Image Inc., Rochester, NY). Usiamo una sutura con un diametro punta finale di 0,21-0,22 mm per un mouse con il peso corporeo di 25-30 g. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave (minimo 121 ° C, 15 PSI, per 15 minuti). Sterilizzare il tavolo operatorio e delle apparecchiature connesse con etanolo al 70%. Anestetizzare uno 8-12 settimane di età del mouse (25-30 g) con il 5% isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) nel 30% O 2 / 70% N 2 O con il sistema V-10 Anestesia (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). Dopo l'induzione dell'anestesia, ridurre il livello di isoflurano e mantenerla a 1,5%. Posizionare il mouse in posizione supina su una piastra elettrica. Inserimento di una sonda rettale, e monitorare e mantenere la temperatura corporea tra i 36,5-37,5 ° C utilizzando il TR-200 del sistema della temperatura homeothermic (Fine Science Tools Inc., Foster City, CA). Accorciare il pelo sulla regione ventrale del collo con tagliaunghie elettrici (Braintree scientifico) per esporre la pelle. Disinfettare il sito chirurgico utilizzando tre applicazioni del 70% di etanolo. Al microscopio stereo dissezione (Nikon, Giappone), fare un 1 cm lunga incisione sulla linea mediana del collo. Usa divaricatori (Braintree scientifico) per esporre il campo operatorio e di individuare il diritto arteria carotide comune (CCA), arteria carotide esterna (ECA), e della carotide interna (ICA). Con attenzione sezionare le arterie circostanti privi di nervi e fascia. Sezionare la Corte dei conti ulteriormente distalmente e coagulare l'(STA) Corte dei conti e la sua arteria tiroidea superiore ramo con un coagulatore bipolare (Howard Instrument Inc., Tuscaloosa, AL). Tagliare la Corte dei conti e STA al segmento coagulato. Liberamente pareggio 8-0 due punti di sutura di seta intorno al ceppo della Corte dei conti. Applicare una pinza vascolare (Strumenti di scienze arti) alla biforcazione del CCA in Corte dei conti e ICA. Fai una piccola incisione alla fine della Corte dei conti ceppo con Vännäs stile forbici a molla (Strumenti di scienze arti). Misurare e registrare la lunghezza di una sutura monofilamento 5-0 arrotondate sulla punta. Inserire la sutura in incisione e avanzare al morsetto. Serrare le due suture di seta intorno al lume quel tanto che basta a garantire ancora preservare la mobilità delle in-abitazione sutura monofilamento. Rimuovere la fascetta dalla biforcazione. Delicatamente anticipo la sutura monofilamento dal lume della Corte dei conti nella ICA per una distanza di 9-10 mm al di là della biforcazione della CCA per occludere l'origine della MCA. La durata dell'intervento è di circa 30-45 min. Sutura l'incisione sul collo e posizionare il mouse in una casella C ° 35 di riposo per recuperare da anestesia, e restituirlo alla gabbia. Di solito, occorrono 5-10 min per i topi di recuperare da anestesia. Per eseguire MCAO transitoria, il ricercatore può ri-anestetizzare il mouse e ritirare la sutura di nuovo nel tronco di Corte dei conti, dopo un periodo di tempo, di solito tra 0,5-2 h. Ventiquattro ore dopo l'induzione di MCAO, anestetizzare il mouse con il 5% isoflurano e l'eutanasia dalla dislocazione cervicale. Decapitare il mouse e raccogliere il cervello. Tagliate il cervello coronale in quattro fette di 2 mm con una matrice cervello (Braintree scientifico) sul ghiaccio. Incubare le fette di cervello in 2% 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) (Sigma-Aldrich) in PBS 1X per 20 minuti a temperatura ambiente per determinare la dimensione e l'estensione dell'infarto. Fissare le fette di cervello nel 10% tamponata neutra soluzione di formalina (Sigma-Aldrich) a 4 ° C fino imaging. L'estensione di infarto può essere quantificato come descritto nella JOVE protocollo 955 ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9. 2. Rappresentante Risultati Il infarti generato da MCAO sono visti nello striato e nella corteccia dorsolaterale. Lo striato è più sensibile all'ischemia rispetto alla corteccia cerebrale. Trenta minuti di MCAO produrrà un infarto solo nel corpo striato, mentre più di un'ora di MCAO danneggia sia striato e la corteccia. Dopo 24 ore MCAO permanenti, la percentuale di infarto totale è ~ 40 ± 5% dell'emisfero e il tasso di mortalità dopo l'intervento chirurgico è ~ 10%. Escludiamo i topi da ulteriori studi, se si verifica un eccessivo sanguinamento durante l'intervento chirurgico, il tempo di funzionamento supera i 90 minuti, i topi non riescono a riprendersi da anestesia entro 15 minuti, o emorragia si trova nelle sezioni di cervello o alla base del circolo di Willis durante l'esame post-mortem . jove_content "> Figura 1. Immagini Rappresentante della TTC-macchiato fettine di cervello (coronale livello 1-4) dopo 24 ore di permanente MCAO. Nel tessuto vivo TTC è enzimaticamente ridotta di deidrogenasi a 1,3,5-triphenylformazan (TPF), che è di colore rosso, mentre nelle aree necrotiche rimane bianca a causa di mancanza di tale attività enzimatica. Pertanto, l'area di infarto può essere identificato dal suo colore bianco a causa della mancanza di conversione del TTC per TPF. Nota: TTC è un po 'di calore e luce instabile sezioni colorate in modo da proteggere dal calore e dalla luce quanto più possibile.

Discussion

MCAO nei topi è comunemente utilizzato per modellare ischemia cerebrale focale in esseri umani. L'uso dei topi per studi corsa è diventato più frequente a causa della disponibilità di ceppi transgenici e knockout. Ci sono alcuni dettagli fondamentali per nota nel protocollo:

1. E 'essenziale per mantenere la temperatura corporea del mouse durante l'intervento chirurgico e prima che si riprenda pienamente dall'anestesia. La temperatura corporea ha effetti sul grado di infarto, diminuisce ipotermia e ipertermia aumenta la dimensione dell'infarto.
2. Esponendo e isolare il CCA e Corte dei conti, evitare di danneggiare il nervo vago vicino e la trachea, che potrebbe aumentare la dimensione infartuale e la vitalità diminuire.
3. Non inserire la sutura monofilamento superiore a 10 mm passare la biforcazione. Una sutura inserito troppo lontano possono perforare l'arteria cerebrale anteriore e causare emorragia cerebrale. Una resistenza può essere sentito quando la sutura è avanzata circa 9-10 mm al di là del punto di biforcazione. In questo caso, il ricercatore dovrebbe smettere di promuovere la sutura e confermare la distanza.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Isoflurane	Chemical	Aerrane, Baxter	95045-588
V-10 Anesthesia system	Equipment	VetEquip	901807
TR-200 Temp Controller	Equipment	Fine Science Tools	21060
Electric clipper	Equipment	Braintree	CLP-9931
Dissecting microscope	Equipment	Nikon	SMZ745T
Retractor system	Equipment	Braintree	ACD-014
Bipolar coagulator	Equipment	Howard Instrument	64000
Silk suture	Material	Harvard Apparatus	510479
Monofilament suture	Material	Harvard Apparatus	723351
Vascular clamp	Equipment	Fine Science Tools	00396-01
Vannas scissor	Equipment	Fine Science Tools	15000-08
Brain matrix	Equipment	Braintree	BS-2000C
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma-Aldrich	T8877
10% neutral buffer formalin	Chemical	Sigma-Aldrich	HT5011