En billig, hög genomströmning metod för samtidig detektering av upp till 43 molekylära mål beskrivs. Tillämpningar av mPCR / RLB inkluderar mikrobiell skriva och detektering av flera patogener från kliniska prover.
Multiplex PCR / bakåt Linje Blot Hybridisering analysen möjliggör detektering av upp till 43 molekylära mål i 43 prover med hjälp av en multiplex PCR-reaktionen följt av sond hybridisering på en nylon membran, som kan återanvändas. Sonder 5 "amin ändras så att fixering till membranet. Primers 5 "biotin modifierad som tillåter detektion av hybridiseras PCR-produkter som använder streptavidin-peroxidas och ett kemiluminiscent substrat via ljuskänslig film. Med låga inställningar och förbrukningsvaror kostnader är denna teknik billig (cirka USD 2 per prov), hög genomströmning (flera membran kan bearbetas samtidigt) och har en kort handläggningstid (cirka 10 timmar).
Tekniken kan utnyttjas på flera sätt. Flera givare kan utformas för att upptäcka sekvens variation inom ett förstärkt enda produkt eller flera produkter kan förstärkas samtidigt, med en (eller flera) prober som används för senare identifiering. En kombination av båda metoderna kan också användas inom en och samma analys. Möjligheten att inkludera flera sonder för en målsekvens gör analysen mycket specifika.
Publicerad tillämpningar av mPCR / RLB inkluderar detektion av gener för antibiotikaresistens 1,2, inskrivning av meticillinresistenta Staphylococcus aureus 3-5 och Salmonella sp 6, molekylär serotypning av Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 och enteroviruses 10,11, identifiering av Mycobacterium sp 12, upptäckt av genitala 13-15 och andningsvägarna 16 och andra 17 patogener och upptäckt och identifiering av mollicutes 18. Dock innebär den mångsidighet av tekniken ansökningarna är praktiskt taget obegränsad och inte begränsat till molekylär analys av mikroorganismer.
De fem stegen i mPCR / RLB är en) Primer och Probe design, b) DNA-extraktion och PCR-amplifiering c) utarbetande av membranet, d) hybridisering och detektion, samt e) Regeneration av membranet.
Den mPCR / RLB metod tillåter samtidig detektering av ett stort antal PCR amplicons. Grund av den höga känsligheten hos kemiluminiscent probe-baserad detektering kan en enda multiplex PCR-reaktionen med ett stort antal primerpar användas för att förstärka DNA-mall.
Om ingen givare signaler fås med ett eller flera prov, utföra gelelektrofores med eventuell kvarvarande PCR-produkten kan skilja på om det är problem med PCR-amplifiering eller sond hybridisering. Om alla givare signaler på membranet är svag eller obefintlig, men gelelektrofores indikerar framgångsrik PCR-amplifiering, möjligheter är problem med märkning av membranet, felaktig förnyelse av membranet efter tidigare användning, felaktig temperatur under hybridisering eller streptavidin inkubation, eller defekt streptavidin- konjugat eller detektering reagens.
Om kontrollprover visar att enskilda givare kan producera falska negativa signaler, enstaka PCR med gel-baserad detektering och efterföljande sekvensering kan utföras för att verifiera förstärkningen av PCR-produkt och att leta efter sekvensen variation vid sonden bindningsställe. Svag eller obefintlig sond signalen kan bero på att stora amplicon storlek: om möjligt alla amplicons bör vara av liknande längd och mindre än 300 bp. Sekundär DNA-strukturer amplicons kan också ge dålig sond bindande, och kan kräva re-design av primers. Individuella primer eller koncentrationer sond kan också varieras för att optimera signalstyrkan.
Falskt positiva signaler på grund av sond bindning av nonamplified grundfärg eller primer-dimer produkt kan undersökas genom att utföra samma PCR med gel-baserad detektering och efterföljande sekvensering. Om detta inträffar, omdesign av sonderna kan krävas. Punktmutationer i sond bindningsställen kan leda till svaga eller frånvarande signaler. Att låta två sonder för varje förstärkt produkt blir enkelt att upptäcka. Denna egenskap kan utnyttjas med noggrann primer och sond design för att upptäcka små sekvens variationer i mål-DNA.
Sammanfattningsvis, medan det finns många metoder för följande produkt upptäckt multiplexa PCR-reaktioner som finns har mPCR / RLB fördelen av att vara hög genomströmning och billigt med låg setup-kostnaderna. Flexibiliteten i metoden medger dess användning i ett brett spektrum av applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Matthew O'Sullivan och Fei Zhou är mottagare av Australiens nationella hälso-och medicinska forskningsrådet Postgraduate Medical Stipendier forskning.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.