Une méthode simple fente blot a été développé pour la quantification de l'hémagglutinine de la grippe virale et la neuraminidase utilisant des anticorps ciblant universelle leurs séquences les plus conservées identifiées par l'analyse bioinformatique. Cette approche innovatrice pourrait fournir une alternative utile pour la détermination quantitative de tous hémagglutinine et la neuraminidase virale.
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Article de méthode
Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot
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Résumé
Résumé
L'hémagglutinine (HA) et neuraminidase (NA) sont deux protéines de surface du virus de la grippe qui sont connus pour jouer un rôle important dans le cycle de vie du virus et l'induction de réponses immunitaires protectrices 1,2. Comme la principale cible des anticorps neutralisants, HA est actuellement utilisé comme marqueur de la puissance et le vaccin contre la grippe est mesurée par immunodiffusion radiale simple (SRID) 3. Cependant, la dépendance de SRID sur la disponibilité des immunsérums correspondants sous-type entraîne un minimum de 2-3 mois de retard pour la sortie de chaque nouveau vaccin. Par ailleurs, malgré les preuves que NA induit aussi une immunité protectrice 4, le montant de NA vaccins contre la grippe n'est pas encore standardisé en raison d'un manque de réactifs appropriés ou méthode analytique 5. Ainsi, de simples méthodes alternatives permettant de quantifier les antigènes HA et NA sont souhaitables pour une libération rapide et un meilleur contrôle de la qualité des vaccins antigrippaux.
Régions universellement conservées dans tous la grippe A disponible HA et NA séquences ont été identifiés par analyse bioinformatique 6-7. Une séquence (désigné comme Uni-1) a été identifié dans l'épitope ne universellement conservé de la HA, le peptide de fusion 6, tandis que deux séquences conservées ont été identifiées dans les neuraminidases, un proche du site enzymatique actif (désigné comme HCA-2) et le autre près de la N-terminale (désigné comme HCA-3) 7. Peptides avec ces séquences d'acides aminés ont été synthétisés et utilisés pour immuniser des lapins pour la production d'anticorps. L'anticorps dirigé contre l'épitope Uni-1 de HA a été en mesure de se lier à 13 sous-types de la grippe A HA (H1-H13) alors que les anticorps contre le HCA-2 et HCA-3 régions de NA ont été capables de se lier tous les 9 sous-types NA. Tous les anticorps ont une spécificité remarquable contre les séquences virales comme en témoigne le constat que pas de réactivité croisée aux protéines allantoïdien a été détectée. Ces anticorps ont ensuite été utilisés universelle pour développer des essais slot blot pour quantifier HA et NA dans les vaccins de grippe A sans la nécessité d'antisérums spécifiques 7,8. Échantillons de vaccin ont été appliquées sur une membrane de PVDF en utilisant un appareil de slot blot ainsi que des normes de référence dilué à différentes concentrations. Pour la détection de HA, les échantillons et les standards ont d'abord été dilué dans une solution saline tamponnée Tris (TBS) contenant de l'urée 4M tandis que pour la mesure de l'AN, ils ont été dilués dans du TBS contenant 0,01% Zwittergent que ces conditions a considérablement amélioré la sensibilité de détection. Suite à la détection de l'HA et NA antigènes par immunoblot avec leurs anticorps universel, intensités du signal ont été quantifiées par densitométrie. Montants des HA et NA dans les vaccins ont ensuite été calculées en utilisant une courbe standard établie avec les intensités du signal des différentes concentrations des références utilisées.
Étant donné que ces anticorps se lient à des épitopes universel en HA ou NA, les enquêteurs intéressés pourraient les utiliser comme outils de recherche dans les immunoessais autre que le slot blot seulement.
Protocole
1. Préparation des réactifs et du matériel
- Avant de commencer la procédure de slot blot, préparer 20_mls de solution d'urée 4M dans du Tris-solution saline tamponnée (Tris 20 mM, NaCl 137 mM, pH 7,6) (TBS) pour l'hémagglutinine ou HA, slot blot, ou d'un 20_mls% 0,01 Zwittergent solution dans le SCT pour la neuraminidase ou NA, slot blot. Alors que l'urée 4M doit être préparé à chaque fois, une solution stock à 10% en DH Zwittergent 2 O est stable pendant au moins 6 mois à température ambiante et peut donc être dilué à 0,01% dans le TBS avant chaque dosage.
- Préparer 2000 ml de tampon de lavage en ajoutant Tween-20 à une solution de TBS ....
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Discussion
La détermination quantitative de la grippe virale HA et NA sont essentiels pour la recherche de vaccins et le développement depuis ces deux protéines de surface sont plus importants composants viraux induire des réponses immunitaires 6-11. Auparavant rapporté des méthodes immunologiques pour la détection de ces protéines nécessitent anticorps spécifique à la souche. La méthode slot simple, reproductible et rapide blot pour quantifier les antigènes HA et NA décrits ici sont adaptés à tous la grippe A HA viraux.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Mme Monika Tocchi pour révision éditoriale du manuscrit. AMH est soutenu par une bourse de l'Université King Abdulaziz, à travers le Bureau culturel saoudien au Canada.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif ou de l'équipement | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Bio-Dot Appareil de microfiltration SF | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Bio-Dot SF papier filtre | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL transfert de membrane (PVDF) | Millipore | IPFL00010 | |
| Pompe à vide | Millipore | WP6111560 | |
| Film Lumière chimiluminescence BioMax | Kodak | 178 8207 | |
| Système FluorChem documentation de gel | Alpha Innotech | 29 à 008-1896X | |
| Anticorps de lapin universelle contre HA et NA antigènes | Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) | Les anticorps sont disponibles par le biais MTA ou peuvent être générées par les chercheurs intéressés, conformément aux procédures décrites précédemment 6,7. | |
| Antigènes de vaccins grippe de référence | CBER / FDA ou NIBSC | ||
| Échantillons vaccin contre la grippe | Couramment disponibles dans la plupart des pays | ||
| L'urée | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Zwittergent 3-14 détergent | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Blotting Blocker grade non-lait écrémé en poudre | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure chèvre anti-lapin IgG (H + L), conjuguée à la peroxydase | Thermo Scientific | 31460 | |
| SuperSignal Ouest Dura Extended Substrat Durée | Thermo Scientific | 34075 |
Références
- Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
- Wood, J. M.
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays
Posted by JoVE Editors on 11/13/2012. Citeable Link.
An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.
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