Vibratom Sectioning für Enhanced Erhaltung der Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ
Summary
Ein einfaches Verfahren der Vibratom Schneiden des Corti-Organ, durch Immunhistochemie und konfokale Mikroskopie folgt beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht eine verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, und somit ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Zelltypen.
Abstract
Das Säugetier-Corti-Organ ist ein hoch geordneter zellulären Mosaik mechanosensorischen Haar und nichtsinnlichen Stützzellen
(Besprochen in 1,2). Visualisierung von diesem zellulären Mosaik oft verlangt, dass das Corti-Organ im Querschnitt ist. Insbesondere kann die nichtsinnlichen Säule und Deiters 'Zellen, deren Kerne sind basal in Bezug auf die Haarzellen befinden, nicht sichtbar gemacht werden, ohne Querschliffe Corti-Organ. Allerdings ist die zarte Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, einschließlich der feinen zytoplasmatischen Prozesse der Säule und Deiters 'Zellen, schwer durch routinemäßige histologische Verfahren wie Paraffin und Kryo-Schnitte, die kompatibel mit Standard-immunhistochemische Färbetechniken sind zu bewahren.
Hier beschreibe ich eine einfache und robuste Verfahren, bestehend aus Vibratom Schnitte der Cochlea, immunhistochemische Färbung dieser Vibratom Abschnitte in whole mount, durch konfokale Mikroskopie verfolgt. Dieses Verfahren wurde in großem Umfang für die immunhistochemische Analyse von mehreren Organen, einschließlich der Maus Gliedmaßenknospe, Zebrafisch Darm, Leber, Bauchspeicheldrüse und Herz (siehe 3-6 für ausgewählte Beispiele) verwendet. Darüber hinaus wurde dieses Verfahren erfolgreiche sowohl für Imaging und quantitificaton der Säule Zellzahl in der Mutante und Kontrollorgane von Corti in beiden Embryonen und erwachsenen Mäusen 7. Diese Methode ist jedoch derzeit nicht weit verbreitet, um die Säugetier-Corti-Organ zu untersuchen. Das Potenzial für dieses Verfahren, um beide bieten verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der erwachsenen Corti-Organ und erlauben die Quantifizierung der verschiedenen Zelltypen beschrieben.
Protocol
Discussion
Das Verfahren der Vibratom Schnitte, durch Immunhistochemie und konfokale Bildgebung gefolgt ermöglicht die Visualisierung des Corti-Organ mit minimalen Gewebeschäden. Offensichtlich zeigen konfokale Bilder aus dem internen Regionen in der Vibratom Abschnitt entnommen ausgezeichnete Erhaltung der Zellmorphologie, die nur durch Fixierung Artefakte begrenzt ist. Konfokale Bilder der Nähe der beiden cut-Oberflächen eines Vibratom Abschnitt entnommen werden oft von den Bildern aus dem internen Regionen zu unterscheiden,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor möchte die Nutzung der Kinder-Forschungsinstitut Imaging Core für die konfokale Mikroskopie und Dr. Jian Zhang für den Vorschlag bestätigen die Abschnitte mit Agaroseperlen montieren. Diese Arbeit wurde vom NIH DC010387 finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Zeiss | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
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