Ce support entière<em> In situ</emProtocole d'hybridation> décrit les étapes essentielles qui assurent des résultats reproductibles de haute qualité pour les études d'expression génique dans des embryons de jour E8.5-E11.5 vieille souris.
Monter toute l'hybridation de situ est une approche très instructive pour définir les profils d'expression génique dans des embryons. L'hybridation in situ dans les procédures sont longues et techniquement exigeant avec plusieurs étapes importantes qui contribuent collectivement à la qualité du résultat final. Ce protocole décrit en détail plusieurs étapes clés de contrôle de qualité pour l'étiquetage de sonde d'optimisation et de performance. Globalement, notre protocole fournit une description détaillée des étapes critiques nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles de grande qualité. Premièrement, nous décrivons la génération de digoxygénine (DIG) des sondes ARN marqués par transcription in vitro de matrices d'ADN générés par PCR. Nous décrivons trois critiques des tests de contrôle qualité pour déterminer le montant, l'intégrité et l'activité spécifique de la DIG sondes marquées. Ces étapes sont importantes pour générer une sonde d'une sensibilité suffisante pour détecter des ARNm endogène dans un embryon de souris ensemble. En outre, nous décrivons les méthodes de fixation et le stockage d'embryons jour E8.5-E11.5 vieille souris pour l'hybridation de situ. Ensuite, nous décrivons des méthodes détaillées pour limiter la protéinase K digestion des embryons réhydratés suivie par les détails des conditions d'hybridation, lavages post-hybridation et le traitement RNase pour enlever hybridation de sonde non spécifique. Un anticorps AP-conjugué est utilisé pour visualiser la sonde marquée et de révéler le profil d'expression de la transcription endogène. Résultats représentatifs sont présentés à partir d'expériences réussies et les expériences typiques sous-optimale.
Les méthodes décrites dans ce protocole ont été adaptés à partir d'un certain nombre de sources différentes et optimisé pour le montage toute E8.5-E11.5 embryons de souris âgés jour. Méthodes de montage toute l'hybridation de situ des embryons de vertébrés est apparu au début des années 1990 2,5-12. Ce protocole a été adapté principalement à partir des méthodes développées pour les embryons de Xénope 7,8 ainsi que la souris 2,11. Dans notr…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R21MH082360 (BGC) et R01HD056315 (GRN), ainsi que l'Université de Géorgie.
Name | Type | Company | Catalogue number | Comments |
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Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate | Reagent | Roche | 11209256910 | |
Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche | 11277057001 | |
Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche | 11274015001 | |
T7 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10881767001 | |
SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10810274001 | |
T3 RNA polymerase | Reagent | Roche | 11031163001 | |
CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche | 4716728001 | |
Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher | BP169-500 | |
Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene | ||
Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma | D5758-100ML | |
Heparin sodium | Reagent | Acros | 41121-0010 | |
hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher scientific | BP2633-500 | |
Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
Blocking reagent | Reagent | Roche | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
Proteinase K | Reagent | Roche | 3115852001 | |
Rnase A | Reagent | Roche | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
Rnase T1 | Reagent | Roche | 10109193001 | |
Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche | 11093274910 | |
BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche | 11 442 074 001 | |
4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National scientific | B7800-2 | |
Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisherbrand | 15-200-402C | |
Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisherbrand | 23-021-400 | |
Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences | 18646A | |
Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisherbrand | 12-550-17 | |
Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma | N8002 | |
Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |