إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز
Summary
الجهود المبذولة لعزل الوحيدات الحفاز تيلوميراز ، TERT بكميات تكفي لدراسات الهيكلية ، وقد اجتمع مع نجاح محدود لأكثر من عقد من الزمان. هنا ، نقدم طرائق عزل TERT المؤتلف castaneum خنفساء الدقيق (<em> التكنيشيوم</em> TERT) ، وإعادة تشكيل نشط<em> T. castaneum</em> بروتين نووي ريبوزي تيلوميراز (RNP) معقدة<em> في المختبر</em>.
Abstract
الجهود المبذولة لعزل الوحيدات الحفاز تيلوميراز ، TERT بكميات تكفي لدراسات الهيكلية ، وقد اجتمع مع نجاح محدود لأكثر من عقد من الزمان. هنا ، نقدم طرائق عزل TERT المؤتلف castaneum خنفساء الدقيق (TC TERT) ، وإعادة تشكيل T. نشط castaneum تيلوميراز بروتين نووي ريبوزي (RNP) المعقدة في المختبر.
تيلوميراز هو الناسخ العكسي المتخصصة (1) الذي يضيف تكرار الحمض النووي قصيرة ، ودعا التيلومير ، لانهاء 3 'من الكروموزومات 2 الخطية التي تعمل على حمايتهم من نهاية إلى نهاية الانصهار وتدهورها. بعد تكرار الحمض النووي ، يتم فقدان قطعة قصيرة في نهاية الكروموسومات (3) ودون تيلوميراز ، مواصلة تقسيم الخلايا حتى يصل في النهاية على حد Hayflick 4. بالإضافة إلى ذلك ، هي نائمة تيلوميراز في الخلايا الجسمية 5 في معظم البالغين ، ولكنه نشط في الخلايا السرطانية 6 حيث أنه يعزز الخلود الخلية 7.
انزيم تيلوميراز الحد الأدنى من المكونات الأساسية يتكون من اثنين : الوحيدات البروتين (TERT) ، الذي يتألف من الوحيدات الحفاز للانزيم وعنصرا لا يتجزأ الحمض النووي الريبي (تير) ، والذي يحتوي على TERT القالب يستخدم لتجميع التيلوميرات 8،9. قبل 2008 ، قد تم حلها فقط عن هياكل المجالات تيلوميراز الفردية 10،11. وجاء تقدم كبير في هذا المجال من تحديد التركيب البلوري لل12 نشاطا ، الوحيدات الحفاز T. castaneum تيلوميراز ، TC TERT 1.
هنا ، فإننا نقدم طرق لإنتاج كميات كبيرة من النشطة ، TERT التكنيشيوم ذوبان للدراسات الهيكلية والبيوكيميائية ، وإعادة تشكيل لتيلوميراز معقدة RNP في المختبر لفحوصات نشاط التيلوميراز. ويظهر لمحة عامة عن الطرق التجريبية المستخدمة في الشكل 1.
Protocol
Discussion
الطريقة المعروضة هنا يسمح لإنتاج كميات كبيرة من الوحيدات الحفاز T. castaneum TERT تيلوميراز في الشكل ، وذوبان نشطة للدراسات الهيكلية والبيوكيميائية. طريقة TERT التكنيشيوم الإفراط في التعبير هي حساسة لبعض التغييرات الطفيفة في درجات الحرارة أو الكثافة خلية من تلك ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
قدم هذا البحث هنا كان مدعوما من قبل وزارة الصحة ولاية بنسلفانيا ، واليسون الطبية ، والخامس والأسس والزمرد.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H. Telomeres: no end in sight. Cell. 77, 621-623 (1994).
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
