활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase
Summary
telomerase의 촉매 subunit을 분리하기 위해 노력 TERT은 구조적 연구를위한 충분한 수량에 10 년 이상 제한된 성공을 만나왔다. 여기, 우리는 재조합 Tribolium castaneum TERT의 절연 (대한 방법을 제시<em> TC</em> TERT)와 활성의 reconstitution<em> T. castaneum</em> telomerase의 ribonucleoprotein (RNP) 복잡한<em> 체외에서</em>.
Abstract
telomerase의 촉매 subunit을 분리하기 위해 노력 TERT은 구조적 연구를위한 충분한 수량에 10 년 이상 제한된 성공을 만나왔다. 여기, 우리는 재조합 Tribolium castaneum TERT (TC TERT)의 분리 및 활성 T.의 reconstitution에 대한 방법을 제시 체외에서 castaneum의 telomerase의 ribonucleoprotein (RNP) 복잡한.
Telomerase는 엔드 – 투 – 엔드의 융합과 파괴로부터 그들을 보호하기 위해 제공 선형 염색체 2의 3 '끝에 telomeres라는 짧은 DNA의 반복을, 추가 전문 역방향 transcriptase 1입니다. DNA 복제에 따라, 짧은 세그먼트는 염색체 3의 끝에와 telomerase없이 손실, 세포는 결국 자신의 헤이 플릭 한계 4에 도달하기 전까지 나누어 진행합니다. 또한, telomerase는 성인에서 가장 체세포 5 휴면이지만, 그것이 세포 영생에게 7 증진 암세포 6 활성화됩니다.
효소의 촉매 subunit와 템플릿 TERT가 telomeres 8,9를 합성하는 데 사용하는 포함하는 필수적인 RNA 구성 요소 (터)를 구성되어 단백질 subunit (TERT) : 최소한의 telomerase 효소는 두 핵심 구성 요소로 구성되어 있습니다. 이전 2008 개별 telomerase 도메인에 대해서만 구조는 10,11을 해결했다. 이 분야에 주요 돌파구는 활성 12 결정 구조의 결정, T.의 촉매 subunit에서 온 castaneum의 telomerase, TC TERT 1.
여기서는 구조적 및 생화 학적 연구에 대한 적극적인, 용해 TC의 TERT, 그리고 telomerase 활동 assays에 대한 체외에서 telomerase의 RNP 복합 reconstitution의 대량 생산을위한 방법을 제시한다. 사용된 실험 방법의 개요는 그림 1에 표시됩니다.
Protocol
Discussion
여기서 제시하는 방법은 T.의 촉매 subunit의 대량 생산을 허용 구조적 및 생화 학적 연구에 대한 가용성, 적극적인 형태로 castaneum의 telomerase의 TERT. TC TERT 통해 표현의 방법은 위에서 언급한 이들의 온도 또는 셀 밀도에 미묘한 변화에 민감하고 극적으로 단백질 표현의 수준에 영향을 줄 수 있습니다. 특히, 우리는 광학 밀도가 600 나노미터에서 0.5에 도달하기 전에 단백질 발현을…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구는 건강의 펜실베니아학과 엘리슨 의료, V 및 에메랄드 기초에 의해 지원되었다 여기를 발표했다.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
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