In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras
Summary
Arbetet med att isolera den katalytiska subenheten av telomeras, TERT, i tillräckliga kvantiteter för strukturella studier, har haft en begränsad framgång i mer än ett decennium. Här presenterar vi metoder för isolering av den rekombinanta Tribolium castaneum TERT (<em> TC</em> TERT) och beredning av den aktiva<em> T. castaneum</em> Telomeras ribonucleoprotein (RNP) komplex<em> In vitro</em>.
Abstract
Arbetet med att isolera den katalytiska subenheten av telomeras, TERT, i tillräckliga kvantiteter för strukturella studier, har haft en begränsad framgång i mer än ett decennium. Här presenterar vi metoder för isolering av den rekombinanta Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) och beredning av den aktiva T. castaneum telomeras ribonucleoprotein (RNP) komplex in vitro.
Telomeras är en specialiserad omvänt transkriptas 1 som ger korta DNA-upprepningar, som kallas telomerer, till 3 "slutet av linjära kromosomer 2 som syftar till att skydda dem från end-to-end-fusion och nedbrytning. Efter DNA-replikation, är ett kort segment förlorat i slutet av kromosom 3 och utan telomeras, fortsätter cellerna att dela tills slutligen nå sin Hayflick Limit 4. Dessutom är telomeras vilande i de flesta kroppsceller 5 hos vuxna, men är aktiv i cancerceller 6 när det främjar cellen odödlighet 7.
Den minimala telomeras enzym består av två huvudkomponenter: proteinet subenheten (tert), som omfattar den katalytiska subenheten av enzymet och en integrerad RNA-komponenten (TER), som innehåller mallen TERT använder för att syntetisera telomerer 8,9. Före 2008 hade endast strukturer för enskilda telomeras domäner lösts 10,11. Ett stort genombrott inom detta område kom från bestämning av kristallstrukturen av den aktiva 12-, katalytisk subenhet T. castaneum telomeras, Tc TERT 1.
Här presenterar vi metoder för att producera stora mängder av de aktiva, lösligt Tc TERT för strukturella och biokemiska studier, och beredning av telomeras RNP-komplex in vitro-analyser telomerasaktivitet. En översikt över den använda experimentella metoder visas i figur 1.
Protocol
Discussion
Den metod som presenteras här ger för produktion av stora mängder av den katalytiska subenheten av T. castaneum telomeras TERT i löslig, aktiv form av strukturella och biokemiska studier. Metoden av Tc TERT över-uttryck är känslig för subtila förändringar i temperatur eller celltäthet från de ovan och kan dramatiskt påverka nivåerna av protein uttryck. Specifikt har vi funnit att förmå cellerna för proteinuttryck innan den optiska densiteten når 0,5 vid 600 nm, eller sänka temperatur…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den forskning som presenteras här stöddes av Pennsylvania Department of Health, Ellison Medical, V och grunden Emerald.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H. Telomeres: no end in sight. Cell. 77, 621-623 (1994).
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
