يصف هذا البروتوكول وسيلة بسيطة وغير مكلفة لقياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم (أي محسن / المروجين) يعيشون في شبكية العين عن طريق الماوس electroporation ازدراع. موصوفة إعداد الحمض النووي ، وتشريح شبكية العين ، electroporation ، ثقافة يزدرع الشبكية ، وبعد التثبيت التحليل النوعي والكمي.
عوامل النسخ الجيني داخل شبكات الخليوي السيطرة على نمط spatiotemporal ومستويات التعبير عن الجينات المستهدفة من قبل ملزم لرابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم (CREs) ، قصيرة (~ 300-600 بي بي) وتمتد من الحمض النووي الجيني الذي يمكن أن تظل قطاعات المنبع والمصب ، أو في غضون والإنترونات من الجينات التي تسيطر عليها. CREs (أي القدرة على / المروجين) وعادة ما تتألف من مواقع متعددة عنقودية ملزمة لكلا تفعيل النسخي وrepressors 1-3. انهم بمثابة تكامل منطقي للمدخلات الانتاج النسخي إعطاء الوحدوي في شكل من أشكال النشاط المروج spatiotemporally دقيقة ودقيقة من الناحية الكمية. وقد اعتمدت معظم الدراسات من الثدييات مقرون التنظيم حتى الآن على transgenesis الماوس كوسيلة للمعايرة وظيفة من CREs محسن 4-5. هذا الأسلوب هو مضيعة للوقت ومكلفة ، وعلى حساب من آثار موقع الإدراج ، إلى حد كبير غير الكمية. من ناحية أخرى ، تم وضع المقايسات الكمية لجنة المساواة العرقية وظيفة الثدييات في نظم زراعة الأنسجة (، على سبيل المثال المقايسات luciferase المزدوج) ، ولكن أهميتها في الجسم الحي من هذه النتائج غالبا ما تكون غير مؤكدة.
Electroporation يقدم بديلا ممتازا لtransgenesis الماوس التقليدي في أنه يسمح كل من التقييم spatiotemporal والكمي لرابطة الدول المستقلة للتنظيم النشاط في الأنسجة الحية الثدييات. وقد كان هذا الأسلوب مفيدا بشكل خاص في تحليل التنظيم رابطة الدول المستقلة في النظام العصبي المركزي ، وخاصة في قشرة الدماغ وشبكية العين 6-8. بينما electroporation الماوس شبكية العين ، سواء في الجسم الحي وفيفو السابقين ، وقد وضعت وصفه على نطاق واسع بواسطة ماتسودا وCepko 6-7،9 ، وقد وضعنا مؤخرا مقاربة بسيطة لقياس نشاط مبصرة محددة CREs في شبكية العين الماوس electroporated 10. بالنظر إلى أن كمية من الحمض النووي التي يتم تقديمها في شبكية العين بواسطة electroporation يمكن أن تختلف من تجربة إلى تجربة ، فمن الضروري أن تدرج "التحكم تحميل' شارك في electroporated في جميع التجارب. في هذا الصدد ، والتقنية هي مشابهة جدا لفحص وluciferase المزدوجة المستخدمة لقياس النشاط المروج في الخلايا المستزرعة.
عندما يعاير مبصرة مقرون التنظيم النشاط ، تتم عادة في الفئران حديثي الولادة electroporation (يوم بعد الولادة 0 ، P0) وهو وقت الذروة انتاج قضبان 11-12. مرة واحدة أنواع الخلايا الشبكية تصبح بعد الإنقسامية ، electroporation هو أقل بكثير من الكفاءة. نظرا لارتفاع معدل الولادات في الفئران حديثي الولادة قضبان وعيدان من أن تشكل أكثر من 70 ٪ من الخلايا في شبكية العين الماوس الكبار ، وغالبية الخلايا التي يتم electroporated في P0 وقضبان. لهذا السبب ، قضيب مبصرات هي أسهل نوع من الخلايا الشبكية للدراسة عبر electroporation. تقنية وصفنا هنا هو مفيد في المقام الأول لقياس نشاط CREs مبصرة.
يزدرع electroporation هي وسيلة بسيطة لقياس نشاط رابطة الدول المستقلة التنظيم في الشبكية الماوس النامية. بالمقارنة مع بلدان رابطة الدول المستقلة ، عن طريق تحليل تنظيمي transgenesis الماوس ، electroporation أرخص بكثير ، وتتطلب الجراء الوليد الماوس فقط ، الحمض النووي ، وأدوات تشريح ، وelectroporation / الأنسجة معدات الثقافة. كما أنها تستهلك وقتا أقل بكثير : تجربة واحدة يتطلب سوى بضع ساعات من وقت الإعداد ، وهي فترة ثقافة حوالي ثمانية أيام ، وبعد ساعات قليلة على نهاية التجربة لتصوير وتحليل البيانات. يزدرع electroporation أيضا متفوقة على تحليل الخلية التنظيمية لرابطة الدول المستقلة ، القائمة على الثقافة منذ يستخدم أنسجة الشبكية الفعلية. يتطور عادة في الشبكية تماما في يزدرع الثقافة أنها تشكل ثلاث طبقات خلوية مختلفة (الطبقة النووية الخارجي ، وطبقة داخلية النووية ، وطبقة الخلايا العقدية) ، على الرغم من فشل مبصرات لوضع شرائح الخارجي.
وثمة ميزة أخرى هي أن يتم استنساخه electroporation ازدراع للغاية. ويبني نفسه في شبكية العين electroporated مختلفة ، حتى في أيام مختلفة ، والنتائج عادة في مستويات التعبير النسبي نفسه. وعلاوة على ذلك ، حيث يعتقد أن البلازميدات electroporated إلى الإبقاء episomally في النواة وليس دمجها في الصبغيات (الكروموسومات) ، فإنها لا تبدو خاضعة لتأثيرات التكامل نفس الموقع الذي يبتلي مقرون التنظيم التحليل التي أجريت في الفئران المعدلة وراثيا.
يزدرع electroporation لديه العديد من القيود. أولا ، يمكن فقط الخلايا التي لا تزال في دورة الخلية transduced بكفاءة electroporation 15. في P0 ، وقضبان وغيرها في وقت لاحق من مواليد أنواع الخلايا الشبكية (خلايا القطبين ، والخلايا عديم الاستطالات ، M ller الدبقية) هي الخلية الرئيسية المستهدفة من السكان بواسطة هذه الطريقة. وقد أبلغ Electroporation من مبصرات مخروط بواسطة P0 electroporation 16 ولكن يبدو أن الكفاءة المنخفضة. والقيد الثاني هو أن الثقافة يزدرع تتجاوز اسبوعين في نتائج تشوه التدريجي لشبكية العين وبالتالي لا يوصى. إذا كان مطلوبا الكمي المروج timepoints في وقت متأخر ، ومع ذلك ، قد يتم تنفيذ في electroporation فيفو 9 ، تليها تشريح الشبكية في timepoint المطلوب ، مسطحة المتصاعدة من تشريح شبكية العين ، وتقدير كما هو موضح في الباب 9. والقيد الثالث هو أن هذا الاختبار هو فقط معتدلة الإنتاجية العالية. خلافا المقايسات القائمة على الثقافة الخلية التي يمكن اختبار المئات من يبني في تجربة واحدة ، وتقنية وصفها في هذا البروتوكول يتطلب حدا أدنى من أحد الشبكية الماوس كله في بناء. وبالتالي ، يمكن معقول فقط بضع عشرات من أن يبني electroporated في يوم واحد.
التحذير واحدة إضافية فيما يتعلق الكمي للنشاط المروج باستخدام النهج الحالي هو ان هناك امكانية ل"ينزف من خلال" لمضان DsRed في القناة GFP ، ولا سيما عندما يعاير المروجين قوي جدا. والسبب في ذلك هو أن الطيف انبعاث DsRed التي تتداخل جزئيا من GFP. للتحايل على هذه المشكلة ، يجب استخدام الفلاتر التي تقلل من الانبعاثات الأمثل للتداخل بين الأطياف وDsRed GFP. عندما يكون هذا المرشح الأمثل مجموعات غير متوفرة ، فإن احتمال حل آخر يتمثل في استخدام البروتين الزرقاء تحول الفلورسنت (على سبيل المثال ، أو BFP CFP) بدلا من GFP.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر كارين لورانس لمساعدتها في بناء المقطع يصف الغرفة electroporation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Electroporation dish, Microslide 453 | BTX Harvard Apparatus | 45-0105 | See protocol section 1 for modifications |
100% silicone rubber aquarium cement | Perfecto Manufacturing | ||
Plastic microtube rack | Fisher Scientific | 05-541 | Only the rack handle will be used |
Dremel tool | For cutting the handle off the plastic tube rack | ||
DMEM | Gibco/Invitrogen | 11965 | |
F12 | Gibco/Invitrogen | 11765 | |
L-Glu/pen/strep | Gibco/Invitrogen | 10378-016 | 100X concentration |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | For 1000X stock, resuspend at 5mg/ml in 5mM HCl and filter-sterilize |
FBS | Gibco/Invitrogen | 26140-079 | |
ECM 830 Square-wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | ||
Nuclepore filters | Whatman | 110606 | 25mm, 0.2μm |
Tissue culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
Glass coverslips #1.5 | Fisher Scientific | 12-544E | 0.16mm thick |
Fluorescent compound microscope equipped with camera | Camera should be monochromatic (e.g., ORCA-ER camera by Hamamatsu) | ||
EGFP/DsRed filter set for compound microscope | Chroma Technology Corp. | 86007 | This filter set minimizes bleedthrough between the red and green chanenels |
ImageJ Software | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |