本协议描述了一个简单而廉价的方式来量化的顺式调控元件的活动(即,增强/促销员)通过外植体电小鼠视网膜生活。 DNA的制备,视网膜剥离,电,视网膜外植体文化,和固定后的分析和定量描述。
在细胞基因网络转录因子控制的时空格局和它们的靶基因的表达水平 ,结合顺式调控元件(CRES),短(300-600 bp)的基因组DNA,可以躺在上游,下游延伸,或在他们所控制的基因的内含子。 CRES( 即 ,增强/促销员)通常由多个群集的结合位点的转录激活和阻遏 1-3 。他们作为转录输入的逻辑集成在spatiotemporally精确,定量准确的启动子活性的形式单一输出。大多数哺乳动物顺式调控的研究,依靠转基因小鼠化验 CRES 4-5增强剂功能的一种手段。这种技术是费时,昂贵,插入现场效果的帐户上,基本上不定量。另一方面,对哺乳动物的综合招聘考试功能的定量分析已开发的组织培养系统 (例如,双荧光素酶检测),但在体内的这些结果的相关性往往是不确定的的。
电穿孔技术提供了一个很好的替代传统的鼠标,因为它允许的顺式调控哺乳动物组织生活活动的时空和定量评估的转基因。此技术已在独联体调节中枢神经系统的分析,特别有用,尤其是在大脑皮层和视网膜 6-8 。虽然在体内和体外小鼠视网膜电,已开发和广泛松田和Cepko 6-7,9描述,我们最近开发出一种简单的方法来量化电穿孔小鼠视网膜10的感光特定CRES活动。由于进入视网膜,电引入的DNA的量可能有所不同,从实验到实验,这是必要的,包括共同电穿孔“内参”在所有的实验。在这方面,该技术是非常相似的双荧光素酶检测,用量化培养的细胞中启动子活性。
化验感光独联体监管活动时,电通常是在新生小鼠(出生后0天,P0),这是高峰棒生产11-12。一旦视网膜细胞类型,成为有丝分裂后,电要少得多有效。鉴于杆出生在新生小鼠和事实棒构成超过70%在成年鼠的视网膜细胞的高利率,多数是在P0电穿孔细胞棒。出于这个原因,棒感光器是最简单的视网膜细胞类型,研究通过电。我们在这里描述的技术主要是有用的量化感光CRES活动。
外植体电穿孔是一种简单的方法量化顺式调控活动在发展中国家的小鼠视网膜。通过鼠标转基因顺式调控分析相比,电便宜得多,需要唯一的新生小鼠的幼崽,DNA,解剖仪器,电/组织培养设备。这也是耗时更短的时间内:一个实验需要的准备时间只有几个小时,一个约八天的文化时期,和几个小时,成像和数据分析实验结束。植电也优于细胞培养为基础的顺式调控的分析,因为实际利用视网膜组织。视网膜的发展相当正常植文化,形成了三个不同的细胞层(外核层,内核层和神经节细胞层),虽然光感受器失败阐述外节。
另一个优点是,植体的电高度重复性。同样构造成不同的视网膜电穿孔,甚至在不同的日子,通常在相同的相对表达水平的结果。此外,因为电穿孔质粒被认为是保持在核episomally并没有纳入到染色体,他们不似乎是受同一个集成的现场效果,困扰在转基因小鼠进行的顺式调控分析。
植电确实有一些局限性。首先,仍然只在细胞周期中的细胞可以有效地转电 15 。在P0,棒和其他以后出生的视网膜细胞类型(双极细胞,无长突细胞,男LLER神经胶质细胞)的主要细胞,这种方法的目标人群。 P0电锥光感受器电穿孔已报告16,但效率低。第二个限制是,外植体文化,超过两个星期,结果在视网膜逐步畸形,因此不推荐。如果发起人量化晚的时间点, 然而,在体内电穿孔9可能被执行,视网膜剥离所需的时间点,平面安装的解剖视网膜,和定量分析,如第9条所述。第三个限制是,只有适度的高通量检测。与细胞培养为基础的分析,可以测试数以百计的结构在一次实验中,在本议定书中所描述的技术要求最低的每一个构造整个小鼠视网膜。因此,只有一对夫妇十几结构可以合理地在一天内被电。
使用本办法的启动子活性的定量方面的额外需要注意的是,有一个潜在的“出血”到GFP通道DsRed的荧光,尤其是当化验非常强的促销员。这样做的原因是发射光谱部分重叠DsRed的是绿色荧光蛋白。为了规避这个问题,优化排放过滤器应使用,最大限度地减少DsRed和GFP的光谱重叠。当这种优化的过滤器设置不到位,另一个潜在的解决方案是使用代替GFP的一个蓝移荧光蛋白(例如,BFP或CFP) 。
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢她的帮助下,劳伦斯的描述电室的建设卡伦。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Electroporation dish, Microslide 453 | BTX Harvard Apparatus | 45-0105 | See protocol section 1 for modifications |
100% silicone rubber aquarium cement | Perfecto Manufacturing | ||
Plastic microtube rack | Fisher Scientific | 05-541 | Only the rack handle will be used |
Dremel tool | For cutting the handle off the plastic tube rack | ||
DMEM | Gibco/Invitrogen | 11965 | |
F12 | Gibco/Invitrogen | 11765 | |
L-Glu/pen/strep | Gibco/Invitrogen | 10378-016 | 100X concentration |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | For 1000X stock, resuspend at 5mg/ml in 5mM HCl and filter-sterilize |
FBS | Gibco/Invitrogen | 26140-079 | |
ECM 830 Square-wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | ||
Nuclepore filters | Whatman | 110606 | 25mm, 0.2μm |
Tissue culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
Glass coverslips #1.5 | Fisher Scientific | 12-544E | 0.16mm thick |
Fluorescent compound microscope equipped with camera | Camera should be monochromatic (e.g., ORCA-ER camera by Hamamatsu) | ||
EGFP/DsRed filter set for compound microscope | Chroma Technology Corp. | 86007 | This filter set minimizes bleedthrough between the red and green chanenels |
ImageJ Software | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |