1. Byggandet av elektroporation kammaren Beställ en microslide, BTX modell 453 med en 3,2 mm gap (Harvard Apparatus # 45-0105) (Fig. 2A). Metallen skenorna bör vara helt tät i botten av bilden. Använd en Dremel verktyg för att skära ett handtag av plast mikrocentrifugrör rack. Skär handtaget till 5 små rektangulära bitar vardera med följande dimensioner: längd 0.8cm, höjd 0.6cm, bredd 0.3cm (Fig. 2B). Dessa plastbitar är återanvändbara distanser som ska användas för att forma enskilda brunnar i microslide kammaren. Sätt plast distanser mellan metall skenor av microslide med jämna mellanrum. Distanserna bör passa väl (Fig. 2C). Skär av spetsen en P200 pipettspets, passa tips till en 3 ml spruta och fyll sprutan med 100% silikongummi akvarium tätningsmedel. Fylla luckorna mellan plast distanser med tätningsmedel. Var noga med att fylla luckorna nerifrån och upp så att inga bubblor bildas mellan tätningsmedel kontakten och basen av microslide. Placera en metall stav ovanpå plastdistanser och fäst det med bindemedel klipp, så att distanserna hålls på plats medan tätningsmedlet torkar (bild 2D-E). Låt tätningsmedlet torka över natten. Ta bort bindemedel klipp, metall stav, och plast distanser (Fig. 2F). Använd en skalpell blad för att rengöra tätningsmedel från toppen av metall räls. Använd en dissekera mikroskop för att undersöka microslide och se till att inga bubblor finns i botten av silikon dammar. Ta bort alla tätningsmedel film som kan ha bildats i brunnarna så att plåten exponeras inuti brunnarna. Fyll en väl med vatten och se till att vattnet inte läcker ut i intilliggande väl (s). Upprepa för alla brunnar. Den färdiga microslide passar i plast skålen med metallstavar intill fönstret på sidan av skålen (fig. 2G), elektroderna kommer så småningom att bifogas metallstavar. 2. DNA-preparation Lägg plasmid-DNA ett 1,5 mL mikrocentrifugrör på is och ta upp volymen till 150μl med destillerat vatten. Flera plasmid arter kan kombineras för samarbete elektroporation (t.ex. en experimentell DsRed konstruera och en kontroll GFP konstruktion). Vid beräkningen av DNA för att lägga till röret, kom ihåg att den slutliga volymen av DNA alikvot kommer att 60μl. Normalt är varje konstruera används vid en slutlig koncentration av 0.5μg/μl. Fällning DNA genom att lägga 15μl 3M natriumacetat (pH 5,2) och 450μl 100% etanol. Invertera eller knacka röret flera gånger för att blanda. Spinn ner DNA vid 4 ° C, 13.200 rpm, i 30 minuter. Tvätta pelleten med 70% etanol, sedan snurra den ner igen vid 4 ° C, 13.200 rpm, i 15 minuter. Lufttorka pellets tills halvt genomskinlig, ca 7 minuter, sedan återsuspendera i 54μl sterilt vatten. Lägg 6μl steril 10X PBS (pH 7,4) och blanda. 3. Eye kollektion Sterilisera elektroporation kammaren och alla instrument med 70% etanol. Medan ögat insamling och dissektion behöver inte göras i en vävnad kultur huva, desinficera dina handskar och stationära maskiner med etanol och försök att upprätthålla sterila förhållanden under hela förfarandet. Förbered petriskålar med dissektion medelhög (1:1 förhållandet DMEM: F12, 100U/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 0.29mg/ml L-glutamin, och 5μg/ml insulin): två 35 mm rätter vardera med 3 ml medium och en 60mm fat med 6 ml medium. Detta steg bör utföras i en vävnadsodling huva. Desinficera huvud och hals på en nyfödd (postnatal dag 0) mus valp med 70% etanol. Snabbt halshugga med sax och för över huvudet till en steril 100mm maträtt. Klipp bort hårbotten med en liten sax för att exponera ögonen. Använd böjd pincett för att försiktigt ösa ögat ur omloppsbana, och placera ögat i en 35mm maträtt som innehåller dissektion medium. Det kan vara till hjälp för att ta bort ögonen under ett dissekera mikroskop med låg effekt. Upprepa steg 3,3 och 3,4 tills alla ögon har samlats in. Håll ögonen på dissektion medel vid rumstemperatur medan dissekera. Du behöver 3-4 ögon per DNA-delmängd. 4. Retinal dissektion Använd 70% etanol för att desinficera både ett rakblad och täckblad av en steril plast överföringspipett. Skär av spetsen på pipetten med klingan så att den kan suga upp en hel öga. Förvara pipetten i plast omslag när den inte används. Överför ett öga från 35mm skålen till 60mm skålen. Enligt dissecting mikroskop med hög effekt, använd fin pincett för att avlägsna vävnad, såsom extraocular muskler och fett från ytan av ögat. Ta sedan bort synnerven genom att nypa bort det vid basen. För att isolera näthinnan, peta ett litet hål in sklera vid limbus. Sätt ett stift från båda par pincett i hålet (tangerar näthinnans yta) och försiktigt riva öppna sklera / RPE. I albino möss, sklera och RPE verkar glänsande förhållande till näthinnans vävnad, vilket är en homogen matt grå färg. I pigmenterade möss är RPE svart. Låt linsen på plats. Använd överföringspipetten att flytta dissekerat näthinnan i den andra 35mm skålen med medium. Upprepa steg från 4,2 till 4,4 tills alla ögon har dissekerat. Förvara näthinnor i ett 37 ° C vävnadsodling inkubator tills du är redo att electroporate. 5. Förberedelse för elektroporation Förbered 35mm rätter av medium. För varje DNA alikvot vara electroporated, behöver du ett fat med dissektion medelstora och ett fat med odlingssubstrat (dissektion medel ökat med 10% FBS). Märk disken på lämpligt sätt. Använd en P200 pipett och sterila 1X PBS att skölja ur kamrarna i elektroporering skålen. Varje kammare har en volym på 60-100μl. Skölj ur varje kammare tre gånger. Fyll kammare med DNA alikvoter. Oanvänd kammare bör fyllas med 60μl 1X PBS. Anslut elektroderna till elektroporation skålen. Använd följande inställningar på electroporator: mode, LV, spänning, 30V, pulslängd, 50 ms, antal pulser, 5, intervall, 950 msek, polaritet, unipolär. 6. Elektroporation Använd fin pincett för att ta tag i näthinnor genom linsen och överföra dem till elektroporation kamrarna. Varje kammare rymmer upp till 3-4 musen näthinnor (Fig. 3). Använd pincett för att rada upp näthinnor så att linsen lutar sig mot metall stång fäst vid positiva elektroden. Rengör pincetten med en Kimwipe efter varje överföring för att undvika överföring av DNA från en kammare till nästa. När alla näthinnor är justerade, tryck på "Start" på electroporator. Små bubblor ska form på metall stång fäst vid negativa elektroden. Koppla bort elektroderna och stänga av electroporator. Använd pincett för att försiktigt flytta näthinnor från kammarens väggar. Använd en steril överföringspipett att överföra näthinnor från kamrarna i 35mm rätterna innehåller dissektion medium. Skölj ur varje kammare tre gånger med sterilt 1X PBS och skölj sedan med sterilt vatten. Spray fat med 70% etanol. 7. Placering näthinnor på filter för kultur Använd en överföringspipett att överföra näthinnor i 35mm rätterna innehåller odlingsmedium. Etikett brunnarna i en steril 6-bra kultur plattan och fyll varje brunn med 3 ml odlingsmedium. Använd steril tång för att placera runt Whatman Nuclepore filter, blanka sidan uppåt, ovanpå mediet i varje brunn. Enligt en dissekera mikroskop, använder en steril överföringspipett att överföra näthinnor på filtret, lins-och-ner. Om näthinnan landar lins-side-up, plocka upp med pipett och försöker placera det igen. Placera inte mer än 4 näthinnor på ett filter och se till att dropparna av medium kring varje näthinna hållas åtskilda från de andra droppar. Observera att vi kulturen näthinnan med linsen intakt, även om andra protokoll kräver att avlägsna linsen innan detta steg 9. Placera kultur plattan i 37 ° C vävnadsodling inkubator (5% CO 2) och växa för önskad tid, vanligtvis åtta dagar. Vår erfarenhet är att ändra mediet är onödigt under åtta dagar kulturen perioden, men ett medium förändring kan krävas för längre kultur perioder. 8. Skörd och flatmounting fluorescerande näthinnan explants Byt substratet i varje brunn med 4% paraformaldehyd / 1X PBS. Om näthinnor fastnar i filter, använda pincett för att vända filter över och försiktigt skala näthinnor bort filtret. Inkubera i paraformaldehyd i 30 min. vid rumstemperatur. Skydda näthinnor från ljus för att undvika blekning av fluorescensen. Skölj näthinnor två gånger i 10 minuter i 1X PBS. Använd en engångspipett att överföra näthinnor på en glasskiva i en liten droppe PBS. Enligt en fluorescerande dissekera mikroskop, använder pincett för att vända näthinnor så att de är electroporated-side-up (dvs lins-och-ned). Placera glas "fötter" gjorda av krossade täckglas (glas skärvor ca 1-2 mm i diameter) i hörnen av bilden, dessa fötter förhindra flackare näthinnan. Placera en intakt glas täckglas över bilden så att den täcker näthinnor och vilar på fötterna. Om det behövs, använd en pipett för att lägga till fler PBS mellan bild och täckglas. 9. Avbildning och kvantifiering av fluorescens i flatmount Använd ettfluorescerande förening mikroskop utrustat med en monokrom kamera för att bilden flatmounted näthinnan vid låg effekt (4X mål) i de röda och gröna kanalerna. Alla näthinnor måste avbildas med samma exponeringstid för en given fluorescerande kanal att möjliggöra jämförelser av fluorescens intensitet. Se till att pixlarna inte är mättade i någon bild, annars exakt kvantifiering kommer att vara omöjligt. Exportera bilder i gråskala TIFF-format. Öppna bilden som för en näthinnan (det vill säga .., röd kanal och gröna kanalen) i ImageJ mjukvara ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). För att skapa denna tutorial, är det grönt fluorescerande kanal (GFP protein) kontrollen konstruktion som är konstant över alla näthinnor i försöket. Den röda fluorescerande kanalen (DsRed protein) är experimentell konstruktion som varierar för varje uppsättning näthinnor. Bilderna ska vara i gråskala. I ImageJ, välj kontrollen gröna bilden och ange en cirkel av intresse med diametern 100 enheter (Analyze / Verktyg / ROI chef / Mer / Ange). Duplicera denna cirkel (ROI chef / Lägg till) för att skapa åtta cirklar totalt. Flytta cirklar 1-5 för att välja fem regioner som jämnt är electroporated, undvika ytterkanterna av näthinnan och regionen överliggande linsen (Figur 4A). Dessutom väljer tre regioner (cirklar 6-8) utanför näthinnan / objektiv för att mäta bakgrundsfluorescens. Välj den röda bilden, avmarkerar "Visa alla" rutan i ROI chef, och åter markera rutan. Alla åtta cirklar ska visas på den röda bilden. Avmarkera alla cirkel koordinaterna i ROI manager. Med den röda bilden valts in genomsnittsvärdena pixelvärde för alla cirklar av intresse (ROI chef / åtgärd), mätningar 1-8 ska visas, där 1-5 är de röda retinal mätningar och 6-8 är röd bakgrund mätningar. Välj den gröna bilden och spela in medelvärdet pixelvärdet, mätningar 9-16 skall infinna sig, där 9-13 är de gröna retinala mätningar och 14-16 är grön bakgrund mätningar. Kopiera mätdata till Excel för analys (Fig. 5). Genomsnitt tre bakgrunden mätningar i både röda och gröna kanalerna. Subtrahera röd bakgrund genomsnitt från varje av de fem retinal mätningar i den röda kanalen, upprepa för den gröna kanalen. För varje retinal region-av-intresse, dela bakgrunden-korrigerad rött mätning av bakgrunden subtraheras-gröna mätning för att normalisera den experimentella röda nivå för att kontrollen gröna nivå (se diagram 5). Bestäm medelvärde och standardavvikelse för alla normaliserade mätningar för ett givet DsRed konstruktion (t.ex. 5 mätningar per näthinnan gånger 3 separata näthinnor). För att kvantitativt kunna jämföra resultaten av electroporations utförs på olika dagar, alltid en "standard" DsRed / GFP nederbörd i varje elektroporering set. Relativa uttryck värden i olika experiment kan jämföras genom att normalisera till uttrycket nivån på denna "standard". 10. Representativa resultat: En bra elektroporation resultat i uttryck av DNA konstruera (s) över 1 / 4 till 1 / 3 av näthinnans yta (fig. 4A). Eftersom staven fotoreceptorer särskilt effektivt transduced, är denna teknik idealisk för att kvantifiera fotoreceptor-specifika promotorn aktivitet (Fig. 4B). Vi använde tidigare denna metod att kvantifiera ett urval av promotorn varianter från stav-specifika Rho och Gnat1 loci 10. Vi fann att det är möjligt att kvantifiera promotor aktivitet över en nästan 300-faldig sortiment. Figur 5 är ett exempel datauppsättning från en enda electroporated näthinnan. I detta exempel var den experimentella konstruera pNrl (1.1kb)-DsRed mäts i den röda kanalen och kontroll konstruera pNrl (3.2kb)-GFP uppmättes i den gröna kanalen. En komplett uppsättning data för pNrl (1.1kb)-DsRed konstruera skulle bestå av 6-9 näthinnor mätt på detta sätt, och standardavvikelse skall beräknas på grundval av alla "DsRed normaliserad till GFP" värden. Om vi skulle jämföra uttrycket nivå pNrl (1.1kb)-DsRed till exempel, pNrl (0.8kb)-DsRed, då båda konstruktioner skulle behöva electroporated med samma GFP kontroll (t.ex. pNrl (3.2kb) – GFP) och avbildade på samma exponeringstider. Det är möjligt att samla data som samlas in på olika dagar om en standard DsRed / GFP elektroporation utförs på varje dag (t.ex. pNrl (3.2kb)-dsRed + pNrl (3.2kb)-GFP). För varje experimentell bygga skulle normaliserade DsRed nivån sedan normaliseras till den normaliserade DsRed nivån för "standard" (pNrl (3.2kb)-dsRed). Tekniken vi beskriver här är framförallt användbart för att kvantifiera aktiviteten hos fotoreceptor CRES 10,13.Cell-typspecifika cis-reglerande aktivitet kan också kvantifieras i ovanligare näthinnan celltyper som bipolär celler 14, men det oftast kräver att områden av intresse för kvantifieras väljas vertikala tvärsnitt snarare än i flatmount förberedelser. Detsamma gäller Cres som driver uttryck i flera celltyper som fotoreceptorer och celler bipolär. Den experimentella förfaranden i övrigt är likartade. Figur 1. Översikt av näthinnans Explantation elektroporation förfarande. Först hela ögon är isolerade från postnatal dag 0 mus ungar och näthinnor är dissekeras (P1). För det andra är de näthinnor placeras i kammare fyllda med DNA och electroporated (P2). Det tredje är de näthinnor placeras på filter och odlade i åtta dagar (P3). Det fjärde är de retinala explants fasta, monterade på diabilder och avbildas. Fluorescensintensitet mäts med ImageJ programvara (P4). Det femte är ImageJ uppgifter som behandlas i ett kalkylprogram för att kvantifiera skillnaderna i aktivitet av olika projektansvariga (P5). Figur 2. Byggandet av elektroporation skålen. A) Oförändrad microslide kammare från Harvard Apparatur, BTX-modell 453 (katalog # 45-0105). B) En Dremel-verktyg används för att skära i handtaget av en plastslang rack. Handtaget är skuren i rektangulära distanser med följande mått: längd 0.8cm, höjd 0.6cm, bredd 0.3cm. C) plastdistanser monteras in i microslide kammaren med lika stora intervaller. Akvarium tätningsmedel sprutas in i mellanrummen mellan distanserna (visas inte). D) En metall bar placeras över distanser. E) Baren och distanser är fästa på bilden med bindemedel clips för att hålla allt på plats som tätningsmaterial torkar över natten. F) distanser tas bort och brunnar testas för att säkerställa att de är vattentäta. G) Den färdiga bilden passar in i plast skålen med metallstänger i anslutning till fönstret på sidan av skålen. Figur 3. Diagram i elektroporation skålen med näthinnor. Kamrarna är fyllda med DNA-lösningar (upp till fem olika lösningar på en gång). Näthinnor är placerade i kammare och orienterade så att linsen lutar mot metal bar ansluten till den positiva elektroden, tre eller fyra näthinnor kommer att passa i alla de fem kammare. Den elektriska strömmen kommer att orsaka de negativt laddade DNA-molekyler för att flytta in i näthinnans celler. Figur 4. A) ImageJ mätning av näthinnans fluorescens nivåer i flatmount. Gråskala flatmount bilder i DsRed (experimentell) och GFP (kontroll)-kanaler öppnas i ImageJ programvara, observera att dessa bilder har färgade illustrativ. Fem mätningar cirklar (1 till 5) är placerade över enhetligt electroporated regioner, undvika kanter och objektiv (streckade linjer). Tre mätningar cirklar (6 till 8) är placerade utanför näthinnan för att fastställa bakgrundsnivåerna fluorescens. B) Tvärsnittsdata bilder av en electroporated retinal Explantation på hög effekt. Den Explantation fastställdes till postnatal dag 8, cryoprotected i 30% sucrose/1X PBS över natten vid 4 ° C, inbäddade i oktober, och Cryo-delad på 12μm. Den fluorescerande konstruerar pNrl (1.1kb)-DsRed och pNrl (3.2kb)-GFP uttrycks i fotoreceptor celler i det yttre nukleära lagret (ENDA). INL, inre nukleära lagret, GCL, ganglion cellager. Figur 5. Behandling av fluorescens data med hjälp av Excel. I steg 1 är medelvärdet pixelvärde för varje mätning cirkel kopieras till tabellen (cellerna B3-B12, F3-F5, H3-H5). Mått # 1-5 är DsRed retinala värderingar och # 6-8 är DsRed bakgrunden värderingar, mätningar # 9-13 är GFP retinala värderingar och # 14-16 är GFP bakgrunden värden. Observera att mätning # 1 och # 9 motsvarar samma mätning cirkel, som gör mätningar # 2 och # 10, och så vidare. I steg 2 är den genomsnittliga bakgrunden värde för DsRed och GFP kanaler beräknas (celler F6, H6). I steg 3 är den genomsnittliga bakgrunden subtraheras från varje retinala mätning (cellerna C3-C12). I steg 4, var bakgrunden-korrigerad DsRed mätningen är normaliserat till motsvarande GFP mätning (cellerna D3-D7).