Un método para preservar, detectar y secuencia de ARN del virus de la gripe aviar fue confirmada y ampliada usando colorantes naturales como muestras de heces de las aves. Esta técnica elimina la necesidad de mantener una cadena de frío y la manipulación de virus infecciosos y puede ser aplicado en un 96-así de alto rendimiento de la instalación.
Virus de influenza aviar (AIVs) infectan a muchos mamíferos, incluyendo seres humanos 1. Estos AIVs son diversos en sus huéspedes naturales, albergando casi todos los posibles subtipos virales 2. Pandemias de gripe humana originalmente provienen de AIVs 3. Muchos de los casos fatales humanos durante los brotes de H5N1 en los últimos años se registraron. Últimamente, una nueva cepa relacionada con AIV se extendió por la población humana, causando cuatro de la 'epidemia de gripe porcina ". Aunque el comercio y la actividad humana de transporte parece ser responsable de la propagación de cepas de alta patogenicidad 5, la dispersión puede ser atribuida en parte a las aves silvestres 6, 7. Sin embargo, el depósito real de todas las cepas de VIA son las aves silvestres.
En reacción a esto y frente a graves pérdidas comerciales en la industria de aves de corral, los grandes programas de vigilancia se han aplicado a nivel mundial para reunir información sobre la ecología de AIVs, y la instalación de sistemas de alerta temprana para detectar ciertas cepas altamente patógenas 08.12. Los métodos tradicionales requieren virológica virus que está intacta y cultivadas antes del análisis. Para ello se requiere estricta cadena de frío con congeladores y pesados procedimientos de bioseguridad para estar en su lugar durante el transporte. Vigilancia a largo plazo es por lo tanto, generalmente se limita a una pocas estaciones de campo cerca de laboratorios bien equipados. Zonas remotas que no pueden ser degustados a menos que los procedimientos de logística complicado su aplicación. Estos problemas han sido reconocidos 13, 14 y el uso de almacenamiento y estrategias alternativas de transporte investigado (alcoholes o guanidina) 15-17. Recientemente, Kraus et al. 18 introdujo un método para recopilar, almacenar y transportar las muestras de VIA, basada en un papel filtro especial. 19 tarjetas FTA preservar el ARN en una base de almacenamiento en seco 20 y hacer que los agentes patógenos inactiva al entrar en contacto 21. Este estudio mostró que las tarjetas de FTA puede ser utilizado para detectar AIV ARN en la PCR con transcripción inversa y que el ADNc resultante podría ser secuenciado los genes del virus y determina.
En el estudio de Kraus et al. 18 un laboratorio aislado del AIV se utilizó, y las muestras fueron manejadas de forma individual. En la extensión que aquí se presenta, muestras de heces de las aves silvestres de la trampa de pato en el Observatorio de Aves Ottenby (SE Suecia) se pusieron a prueba directamente para ilustrar la utilidad de los métodos en condiciones de campo. La captura de los patos y la recogida de muestras de hisopos cloacales se demuestra. El protocolo actual incluye aumento de escala del flujo de trabajo de la manipulación de un solo tubo con un diseño de 96 pozos. Aunque es menos sensible que los métodos tradicionales, el método de tarjetas FTA proporciona un excelente complemento a los sistemas de vigilancia de gran tamaño. Se permite la recolección y análisis de muestras de cualquier parte del mundo, sin la necesidad de mantener una cadena de frío o de las normas de seguridad con respecto al envío de reactivos peligrosos, como el alcohol o guanidina.
El protocolo descrito aquí proporciona un método complementario a la pantalla de muestras fecales o similar para la presencia de VIA. Fue diseñado especialmente para la recogida de muestras rápido y fácil. Esto hace posible que las personas menos entrenadas, como cazadores o gestores de la vida silvestre, para contribuir a la vigilancia de la AI. Nada de cadenas de frío se deben aplicar, a pesar de la congelación de las muestras, se recomienda siempre que sea posible. A los pocos días de la temperatura ambiente, por ejemplo durante el transporte al laboratorio, no fueron un problema para las moléculas de ARN en las tarjetas de TLC, siempre y cuando las tarjetas se mantuvo seco. Otros no refrigerados los sistemas de almacenamiento que se están evaluando por la comunidad científica, como el alcohol de 15 o 16 de guanidina, requieren un régimen especial de envío debido a su naturaleza peligrosa. En contraste, el método de la tarjeta TLC no requieren el envío de materiales peligrosos. Sin embargo, otro medio de almacenamiento interesante a este respecto es RNAlater ™ que no es peligroso, ya sea 17. Análisis de la muestra se puede realizar en cualquier laboratorio molecular estándar. No requiere equipo especial que no sea para siempre las reacciones de PCR y secuenciación capilar que se necesitaba. Todas las medidas que podrían llevarse a cabo sin un nivel de bioseguridad, porque ya en la recogida de muestras, los agentes patógenos potenciales fueron desactivados por la actividad antibacteriana y antiviral de la tarjeta FTA.
La contaminación cruzada de muestras y posterior de falsos positivos no se han observado en nuestras pruebas con muestras de aves silvestres. Sin embargo, cuando se trabaja con RNA y PCR siempre es recomendable prestar especial atención a los lugares de trabajo limpios y las habitaciones separadas para los pasos de pre-y post-PCR. Trabajar en una campana de extracción, disminuye el riesgo de contaminación de aerosoles en el laboratorio. Pipeteo debe llevarse a cabo con puntas con filtro.
De un estudio previo de las muestras tomadas al mismo tiempo de los patos mismo sabemos que seis de las 84 muestras fueron positivas por el tiempo real tradicional método RT-PCR 24 y los valores de Ct de tiempo real RT-PCR se conocen. Las dos muestras positivas detectadas por nuestro método de madre de los patos que tenían valores de Ct <30 (que indica una alta concentración de ARN viral). Las otras cuatro muestras que dieron positivo con el protocolo tradicional tenían valores de Ct> 30 (menor concentración) y no pudo ser detectada por el protocolo.
Sólo las muestras con títulos de virus relativamente altos fueron positivos en nuestro ensayo, y es probable que la sensibilidad del método fue el origen de la imposibilidad de detectar todas las muestras positivas. Además, el tamaño de la muestra en el estudio era muy baja y el método puede ser completamente desarrollado y evaluado si los experimentos más controlada y rigurosa se llevan a cabo. Sin embargo, si estas muestras se han recogido de una zona remota, el análisis tradicional no habría sido posible en absoluto. Además, estos primeros resultados se derivan de las experiencias piloto que se necesita una mayor optimización. Un período de dos años de almacenamiento en un congelador a -20 ° regulares C después de la toma de muestras, probablemente también se ve afectada la calidad del ARN viral. Que esto sea posible la degradación del ARN es un tema importante cuando se trata de guardar a temperatura ambiente de virus inactivados. Las muestras almacenadas en los líquidos alternativos como se mencionó anteriormente sufren de una degradación significativa que afecta el análisis de los tramos más largos del genoma viral 16. Aunque no han sido evaluados en nuestro estudio, las tarjetas de FTA han demostrado ser muy adecuado para conservar intactas las moléculas de ARN en otros sistemas de ARN que son muy similares a los virus de la gripe aviar 25, 26.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a Bert Dibbits de asistencia técnica. La cría de animales y Grupo de Genómica, la Universidad de Wageningen, Países Bajos, generosamente nos acogió en su laboratorio. El personal del Observatorio Ottenby Bird, Suecia, se agradece trampeo y muestreo del ánade real, en particular, Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Magnusson y Christopher Andersson Stina. Damos las gracias a Sanne Svensson, Qvist Jonatan y Per-Axel Gjöres para el rodaje en Ottenby, y Camón Mano para la filmación en el laboratorio. Daniel siempre Bengtson bellas fotografías de pato para la parte de vídeo de esta publicación. Más material libre de la Biblioteca Pública de los CDC de la imagen de la Salud (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/ ) se utilizó: El microscopio electrónico (n º 280, por el Dr. Erskine Palmer) e ilustración (n º 11823; por Douglas Jordania) del virus de la influenza. El apoyo financiero fue dada por el KNJV (Royal Netherlands Hunters Association), el Ministerio holandés de Agricultura, Faunafonds y la Stichting de Fideicomisos Eik (tanto en los Países Bajos), el Consejo Sueco de Investigación (concesión no. 2.007-20.774) y la CE fundada Newflubird proyecto. Productos químicos de aislamiento de ARN fueron un generoso regalo de Ambion, Inc, la compañía de ARN. Esta es la contribución N º 245, del Observatorio de Aves Ottenby.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |