zebrafish गुर्दे दोनों गुर्दे और hematopoietic वयस्क स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए घर है, और एक उत्कृष्ट एक हड्डीवाला मॉडल जीव में इन प्रकार की कोशिकाओं और उनके संतान का अध्ययन करने का अवसर का प्रतिनिधित्व करता है. यहाँ, हम एक विस्तृत विच्छेदन की प्रक्रिया है कि शोधकर्ता की पहचान और शल्य चिकित्सा हटायें वयस्क zebrafish गुर्दे, जो सेल अलगाव, प्रत्यारोपण, और गुर्दे और / या रक्त कोशिका आबादी की अभिव्यक्ति अध्ययन जैसे अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सक्षम बनाता है प्रदर्शित करता है.
Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals. Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.
वयस्क स्टेम कोशिकाओं गतिशील और आवश्यक घटक है कि वयस्क शरीर एक फार्म को बनाए रखने रहे हैं. वयस्क स्टेम कोशिकाओं को भी क्षति प्रतिक्रिया सेवा है कि रोग राज्यों के दौरान शरीर incurs, और वयस्क स्टेम सेल की शिथिलता या हानि अंग समारोह की गिरावट के लिए नेतृत्व और कैंसर दुर्दमताओं ड्राइव और उम्र बढ़ने के लिए योगदान करने के लिए फंसाया गया है सकते हैं. वयस्क स्टेम कोशिकाओं सेलुलर गुण है कि उन्हें विभेदित सेल प्रकार से अलग दिखा रहे हैं. कोशिका विभाजन पर, वयस्क स्टेम कोशिकाओं आत्म नवीकरण और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का उत्पादन है कि बारी में वृद्धि अलग विभेदित संतानों के लिए दे सकते हैं करने में सक्षम हैं. मार्ग है कि ऊतक 1 homeostasis में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका की वजह से सेल भाग्य का निर्णय और वयस्क स्टेम सेल की शक्ति को विनियमित समझ में बहुत रुचि है . उदाहरण के लिए, कई वैज्ञानिकों वर्तमान संकेत है कि अपने आला में विभिन्न वयस्क स्टेम सेल आबादी, या विशेष microenvironment, और कैसे इस जगह humoral कारकों से प्रभावित है को बनाए रखने की पहचान की तलाश है.
वयस्क hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) pluripotent कोशिकाओं है कि ईंधन 8 पशुओं में रक्त कोशिकाओं के नित्य कायाकल्प कर रहे हैं . Hematopoiesis एक जीवंत प्रक्रिया है कि एक हड्डीवाला जीव के जीवन के दौरान लगातार चल रही है क्योंकि परिपक्व विभेदित रक्त कोशिका प्रकार अल्पकालिक हैं और इसलिए नियमित रूप से मंगाया जाना चाहिए है. जैसा कि वे विभाजन, HSCs स्वयं renewing और progenitors कि erythroid, megakaryocyte, lymphoid और माइलॉयड प्रजातियों को जन्म दे की एक श्रृंखला का निर्माण करके इस महत्वपूर्ण मांग की आपूर्ति. इन रक्त कोशिका प्रकार के प्रत्येक संचलन में ऊतकों को गैस विनिमय प्रदान करने, रक्त वाहिकाओं के लिए थक्का बनने का मतलब है, या हमलावर रोगजनकों के खिलाफ रक्षा तंत्र द्वारा चोटों को सील करने के लिए एक तरीका सहित अद्वितीय कार्य करता है. जबकि HSCs कई वर्षों के लिए मान्यता दी गई है, आकर्षक सवालों के एक ढेर सारे इन अद्भुत कोशिकाओं के बारे में अनुत्तरित रह. हाल के अध्ययनों से अलग दीर्घकालिक आत्म नवीकरण, गुण, और आला उपकरणों और संकेत है कि HSC 8 व्यवहार मिलाना की व्याख्या के साथ HSCs की उपवर्गों की पहचान की है. zebrafish hematopoiesis अनुसंधान मानदंड के cornerstones के बीच अब इस पशु 8 मॉडल की आनुवंशिक और आणविक विशेषताओं पर आधारित है. Zebrafish उपयोग अनुसंधान HSC जीव विज्ञान के बारे में उपन्यास अंतर्दृष्टि है कि स्तनधारियों की तरह उच्च रीढ़ के साथ संरक्षित कर रहे हैं, मछली रक्त जांच 8 की जैव चिकित्सा प्रासंगिकता पर बल करने के लिए नेतृत्व किया गया है.
ऐतिहासिक, HSCs के बारे में ज्ञान पता चलता है कि शरीर के अन्य अंगों में वयस्क स्टेम सेल द्वारा रखा जाता है की मांग अभियानों के लिए रास्ता प्रशस्त किया है. कई वयस्क स्टेम सेल आबादी अब मौजूद सराहना कर रहे हैं, विविध संरचनाओं भर में मस्तिष्क से आंत, त्वचा, और कंकाल की मांसपेशी को लेकर. स्टेम सेल के क्षेत्र में निरंतर प्रयासों की पहचान करने के लिए कैसे वयस्क स्टेम सेल और अन्य विभेदित सेल प्रकार विभिन्न सेटिंग्स में बढ़ाया शक्ति प्रदर्शित कर सकते हैं चाहते हैं.
गुर्दे के लिए सम्मान के साथ, वहाँ के रूप में कि क्या गुर्दे की स्टेम कोशिकाओं मौजूद 16 nephrologists के बीच काफी बहस कर दिया गया है. स्वतंत्र निष्कर्ष है कि पुनर्योजी क्षमता की डिग्री बदलती के अधिकारी स्तनधारियों में गुर्दे की कोशिकाओं की आबादी की प्रलेखित है, लेकिन इन रिपोर्टों की एक जोड़नेवाला समझ अभी तक प्राप्त किया जा. दिलचस्प है, वहाँ मजबूत धारणा है कि कई मछली प्रजातियों कोशिकाओं है कि robustly क्षतिग्रस्त नेफ्रॉन के उत्थान ईंधन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कर सकते हैं 9 वयस्कता के दौरान पूरी तरह से नया नेफ्रॉन बढ़ने के अधिकारी के समर्थन में सबूत है. हाल ही में काम 10,11 zebrafish में वयस्क गुर्दे स्टेम कोशिकाओं के आणविक पहचान की पहचान की है, और इन तथाकथित गुर्दे स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (RPCs) 11 आत्म नवीकरण की शक्ति का प्रदर्शन किया. भविष्य के अध्ययन पता लगाने के लिए कि क्या अनुरूप गुर्दे की कोशिकाओं स्तनधारियों में मौजूद हैं की जरूरत है. फिर भी, सेलुलर और आणविक तंत्र है कि मछली RPCs को विनियमित के बारे में जारी जांच कैसे पुनर्योजी feats स्तनधारी गुर्दे में प्रेरित किया जा सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है. यह स्पष्ट है कि बहुत RPCs के बारे में समझा जा रहता है, और कई अब zebrafish शोधकर्ता के लिए उपलब्ध उपकरणों के लिए इन पेचीदा सवालों से निपटने के लागू किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल में, हम संरचनात्मक और वयस्क zebrafish गुर्दे की पहचान विच्छेदन के लिए हमारी पद्धति का वर्णन. वैकल्पिक कदम के लिए एक उदर विच्छेदन कैंची का उपयोग चीरा उदर गुहा के साथ खोलने जैसे गुर्दे, टुकड़े करना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, हम पूरे गुर्दे तक पहुँचने जब पेट की दीवार खुला टिकी है और सिर हटा दिया जाता है में सबसे अधिक सफलता का सामना करना पड़ा है. रक्त और गुर्दे की समान शोधकर्ताओं जो अलग है और इन प्रकार की कोशिकाओं के साथ काम करना चाहते हैं या तो विच्छेदन विधि का उपयोग कर सकते हैं. यह ध्यान दिया जाना चाहिए चाहिए कि हम अलग और काम करने के लिए विधि का वर्णनzebrafish वयस्क गुर्दे के साथ जी निश्चित रूप से वैज्ञानिकों ने वयस्क स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के प्रश्नों का पीछा करने के लिए, इस अंग के विच्छेदन के रूप में उन शरीर क्रिया विज्ञान से लेकर उम्र बढ़ने के लिए विषयों पर जांच का पीछा शोधकर्ताओं के लिए अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं इच्छा तक सीमित नहीं है. इसके अलावा, इस पद्धति ट्रांसजेनिक्स जैसे अन्य प्रौद्योगिकियों के साथ युग्मित किया जा सकता है, molecularly इतनी के रूप में और फिर लेबल शुद्ध और wildtype या आनुवंशिक उत्परिवर्ती 11 zebrafish से खून या गुर्दे की कोशिकाओं के असतत उप – जनसंख्या अध्ययन. आगे देख रहे हैं, ऐसे स्टेम और पूर्वपुस्र्ष सेल प्रकार के विस्तृत शुद्धीकरण प्रक्रियाओं कैसे उनके व्यवहार नियंत्रित किया जाता है के बारे में प्राप्त ज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में प्रत्यारोपण या पूर्वज संवर्धन के रूप में परिचालन परीक्षण के आधार गठन के द्वारा जो शक्ति और इन कोशिकाओं की पहचान में परिभाषित किया गया है. Hematopoietic पूर्वपुस्र्ष संस्कृति तरीकों में हाल के अग्रिमों के अध्ययन के लिए कई नए रास्ते खोल, और गुर्दे की 17 आबादी के संवर्धन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. Zebrafish रासायनिक आनुवंशिकी मार्ग है कि HSCs और विभिन्न 18-20 संदर्भों में गुर्दे progenitors मिलाना, और ऊपर कोशिका जीव विज्ञान तकनीक के साथ संयोजन में परीक्षण के लिए एक उपयोगी अवसर हो करने के लिए जारी रहेगा की पहचान करने में सफल रहा है. साथ में ले ली, रुधिर विज्ञान और नेफ्रोलॉजी के क्षेत्र zebrafish मॉडल का उपयोग कर करने के लिए groundbreaking के योगदान की एक संख्या है, और इन Arenas में अनुसंधान जारी रखा, आने वाले वर्षों में फिराना आगे परिवर्तनकारी अंतर्दृष्टि का वादा किया है.
The authors have nothing to disclose.
रॉ इच्छाओं Zon डेविडसन और अनुसंधान प्रयोगशालाओं के सदस्यों रणनीति है कि उत्तरोत्तर वयस्क zebrafish में पिछले एक दशक में इस विच्छेदन तकनीक के आकार को विकसित करने में मदद करने के लिए अपने असंख्य योगदान के लिए धन्यवाद. इसके अलावा, हम उत्कृष्ट हमारे zebrafish कॉलोनी के लिए चल रहे पशुपालन देखभाल प्रदान करने के लिए Notre Dame सेंटर के Zebrafish अनुसंधान के लिए स्टाफ सदस्यों के लिए हमारे आभार व्यक्त करना चाहते हैं. रॉ NIH-NIDDK अनुदान DK083512 पुरस्कार से अनुसंधान के वित्तपोषण garnered, और उदार प्रयोगशाला Notre डेम विश्वविद्यालय से धन शुरू हुआ.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Dissection scissors | Roboz | RS-5882 |
Dissection forceps | Roboz | RS-5010 |
Dissection angled forceps | Roboz | RS-5058 |
Tricaine | Sigma | E10521 |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 |