वयस्क Zebrafish गुर्दे की विच्छेदन

Summary

zebrafish गुर्दे दोनों गुर्दे और hematopoietic वयस्क स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए घर है, और एक उत्कृष्ट एक हड्डीवाला मॉडल जीव में इन प्रकार की कोशिकाओं और उनके संतान का अध्ययन करने का अवसर का प्रतिनिधित्व करता है. यहाँ, हम एक विस्तृत विच्छेदन की प्रक्रिया है कि शोधकर्ता की पहचान और शल्य चिकित्सा हटायें वयस्क zebrafish गुर्दे, जो सेल अलगाव, प्रत्यारोपण, और गुर्दे और / या रक्त कोशिका आबादी की अभिव्यक्ति अध्ययन जैसे अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सक्षम बनाता है प्रदर्शित करता है.

Abstract

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine¹. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans¹. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology². There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish³. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques⁴, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer⁵. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish^6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate⁸. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species^9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals. Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)^11,12, expression profiling^13,14, and transplantation^11,15. We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

Protocol

1. वयस्क zebrafish गुर्दे की एक unfixed जानवर नमूना से विच्छेदन विच्छेदन के लिए उम्र में 3-6 महीने के बीच एक वयस्क zebrafish का चयन करें. यह एक डिश में 0.2% Tricaine पीएच 7.0 के साथ लगभग 4-5 मिनट के लिए रखने, ध्यान से देखने के लिए देखने के लिए कि गहरे नाले चलती है और दिल की धड़कन बंद हो जाता है बंद करके मछली euthanize. एक चम्मच का प्रयोग, Tricaine स्नान से समाधान की एक छोटी राशि में मछली, लिफ्ट समाधान छानना और धीरे से एक कागज तौलिया पर पशु जगह. विच्छेदन कैंची की एक तेज जोड़ी का प्रयोग पशु के सिर को हटाने, गिल operculum (चित्रा 1, एक पथ) के पीछे सिर्फ एक कट बनाने के लिए. एक biohazard बर्बाद कंटेनर में सिर त्यागें. विच्छेदन कैंची का प्रयोग जानवर के एक लंबे वेंट्रल चीरा बनाने, सिर से शुरू और दुम फिन (1 चित्रा, पथ बी) के आधार पर पूंछ में समाप्त करके शरीर, खुले. जानवर के आंतरिक अंगों निकालें विच्छेदन चिमटी / संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, और उन्हें biohazard कचरे में जगह है. पृष्ठीय शरीर की दीवार ब्रश नहीं सावधान रहो, के रूप में इस गुर्दे का स्थान (चित्रा 2) है. यदि आप एक महिला मछली का चयन किया है, आप करने के लिए विकासशील अंडे शरीर गुहा, जो सबसे अधिक आसानी से संदंश या चिमटी की एक angled जोड़ी का उपयोग किया जा सकता है बाहर निकालना आवश्यकता होगी. विच्छेदन सुइयों का प्रयोग करने के लिए एक विच्छेदन ट्रे के लिए शरीर की दीवारों को खोलने के पिन और पिन है ताकि गुर्दे visualized किया जा सकता है कोण. गुर्दे एक विशेषता (सिर, ट्रंक / काठी, पूंछ) आकार और रंग के अधिकारी, काले hued pigmentation (चित्रा 2) के साथ interspersed किया जा रहा है. तुम भी परिधीय रक्त, जो नीचे अंग संरचना के midline रन के साथ भरा महाधमनी देख सकते हैं. पृष्ठीय शरीर की दीवार से अलग गुर्दे, संदंश की एक जोड़ी का उपयोग गुर्दे लिफ्ट के रूप में आप संयोजी ऊतक है कि इसे आबाद से अंग अलग ठीक संदंश का प्रयोग करें. धीरे वांछित वाहन में आगे microcentrifuge FACS तैयारी के लिए 1x पीबीएस युक्त ट्यूब जैसे रहते सेल के अध्ययन, के लिए गुर्दे की जगह है. 2. तैयारी और एक निश्चित जानवर नमूना से वयस्क zebrafish गुर्दे के विच्छेदन 4% paraformaldehyde/1X PBST के समाधान तैयार है. उबाल लें समाधान के समाधान में पीएफए ​​भंग, तो 4 डिग्री सेल्सियस तक मिश्रण शांत और 0.1% dimethylsulfoxide जोड़ें. हम हौसले से बनाया पीएफए ​​समाधान का उपयोग कर के रूप में जमे हुए aliquots विरोध से ऊतक के संरक्षण के साथ सबसे अधिक सफलता मिली है. वयस्क विच्छेदन के दौरान zebrafish डूब करने के लिए पर्याप्त समाधान करें. पर्याप्त विच्छेदन के दौरान वयस्क zebrafish डूब निर्धारण करने के लिए समाधान के साथ एक विच्छेदन ट्रे भरें. हम इस खुर्दबीन के नीचे तैनात ट्रे, जो एक रासायनिक हुड में रखा जा सकता है है निर्धारण odors के लिए जोखिम को कम करने के साथ बाद के चरणों का प्रदर्शन. विच्छेदन के लिए उम्र में 3-6 महीने के बीच एक वयस्क zebrafish का चयन करें. यह एक डिश में लगभग 5 मिनट के लिए 0.2% Tricaine पीएच 7.0 के साथ रखने के द्वारा मछली euthanize, ध्यान से देखने के लिए कि गहरे नाले और दिल रोक पिटाई. एक चम्मच का प्रयोग, Tricaine स्नान से समाधान की एक छोटी राशि में मछली, लिफ्ट समाधान छानना और धीरे से एक कागज तौलिया पर पशु जगह. विच्छेदन कैंची की एक तेज जोड़ी का प्रयोग पशु के सिर को हटाने, गिल operculum (चित्रा 1, एक पथ) के पीछे सिर्फ एक कट बनाने के लिए. एक biohazard बर्बाद कंटेनर में सिर त्यागें, और तुरंत विच्छेदन पीएफए ​​युक्त ट्रे में जानवरों की जगह. विच्छेदन कैंची का प्रयोग करें एक लंबे वेंट्रल चीरा बनाने, सिर से शुरू और दुम फिन (1 चित्रा, पथ बी) के आधार पर पूंछ में समाप्त जानवर के शरीर, खुला, और आंशिक रूप से के दौरान जलमग्न शरीर रखना प्रक्रिया. जानवर के आंतरिक अंगों निकालें विच्छेदन चिमटी / संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, और उन्हें biohazard कचरे में जगह है. पृष्ठीय शरीर की दीवार ब्रश नहीं सावधान रहो, के रूप में इस गुर्दे का स्थान (चित्रा 2) है. विच्छेदन सुइयों का प्रयोग के लिए खुला शरीर दीवारों पिन और पिन ताकि गुर्दे visualized किया जा सकता कोण. गुर्दे एक विशेषता (सिर, काठी, पूंछ) आकार और रंग, काले hued pigmentation (चित्रा 2) के साथ interspersed किया जा रहा है अधिकारी होंगे. तुम भी परिधीय रक्त, जो नीचे अंग संरचना के midline रन के साथ भरा महाधमनी देख सकते हैं. नमूना रातोंरात फिक्स, 4 में ट्रे रखने ° सी जब आप वांछित नमूनों की व्यवस्था के साथ किया जाता है. अगले दिन, ट्रे से पीएफए ​​समाधान निकालने और 1x PBST के साथ की जगह. ठीक संदंश का प्रयोग करें ध्यान से पृष्ठीय शरीर दीवार से अलग गुर्दे, संदंश की एक जोड़ी का उपयोग गुर्दे लिफ्ट के रूप में आप संयोजी ऊतक है कि इसे आबाद से अंग अलग. गुर्दे ऊतक लगानेवाला समाधान में DMSO से मुलायम और लचीला हो सकता है, यह एक टुकड़ा में पूरे गुर्दे अंग काटना संभव बना. एक व्यापक प्रयोग करेंबोर हस्तांतरण करने के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में गुर्दे की जगह pipet. गुर्दे अब आगे संसाधित किया जा सकता स्वस्थानी जीन अभिव्यक्ति वांछित अध्ययन पर आधारित अध्ययन में histological या पूरे माउंट आचरण. 3. प्रतिनिधि परिणाम: कदम है कि चित्र 1 में diagrammed विच्छेदन प्रक्रिया से संकेत मिलता है. गुर्दे की अपनी विशेषता आकार और रंगाई, और जानवर के शरीर गुहा के पृष्ठीय दीवार पर शारीरिक स्थान के आधार पर पहचाना जा सकता है है, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है. एक निश्चित गुर्दे नमूना, स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट के विच्छेदन के बाद ब्याज की एक जीन की अभिव्यक्ति स्थानीयकरण इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है. चित्रा 1: प्रक्रिया है कि zebrafish वयस्क गुर्दे विदारक के लिए प्रत्यक्ष अभिगम के लिए सक्षम बनाता है. (ए) euthanized zebrafish एक stepwise फैशन में dissected है (संख्या और तीर द्वारा इंगित) शोधकर्ता पूरा गुर्दे अंग के लिए आसान पहुँच दे. उदर गुहा की छवियाँ पहले (बी) और बाद में (सी) पेट अंगों को हटाने. चित्रा 2: एक unfixed नमूने में zebrafish गुर्दे की विज़ुअलाइज़ेशन. शरीर गुहा में अंगों के बाद हटाने, गुर्दे एक एकल, चपटा अंग है कि संयोजी ऊतक (ए) के माध्यम से पृष्ठीय शरीर दीवार के अनुयायी है के रूप में प्रकट होता है, और schematized गया (बी) के लिए अपनी संरचनात्मक आकार दिखाने के लिए. चित्रा 3: सीटू पूरे वयस्क गुर्दे अंग पर प्रदर्शन hybridizations में पूरा माउंट. (ए) cadherin17 टेप वयस्क गुर्दे nephrons की छोटी नली में पता चला रहे हैं, में बढ़ा (ए ') (बी) mafba टेप वयस्क गुर्दे (पैनल में पूरे tubule तुलना ए) में प्रॉक्सिमल नेफ्रॉन सेल प्रकार स्थानीयकृत हैं. (बी' ) mafba अभिव्यक्ति की एक बढ़े हुए देखने से पता चलता है कि टेप विशेष रूप से रक्त (glomerulus) फिल्टर और समीपस्थ जटिल छोटी नली (पीसीटी) के podocyte कोशिकाओं (पी) के लिए स्थानीयकृत रहे हैं.

Discussion

वयस्क स्टेम कोशिकाओं गतिशील और आवश्यक घटक है कि वयस्क शरीर ^एक फार्म को बनाए रखने रहे हैं. वयस्क स्टेम कोशिकाओं को भी क्षति प्रतिक्रिया सेवा है कि रोग राज्यों के दौरान शरीर incurs, और वयस्क स्टेम सेल की शिथिलता या हानि अंग समारोह की गिरावट के लिए नेतृत्व और कैंसर दुर्दमताओं ड्राइव और उम्र बढ़ने के लिए योगदान करने के लिए फंसाया गया है सकते हैं. वयस्क स्टेम कोशिकाओं सेलुलर गुण है कि उन्हें विभेदित सेल प्रकार से अलग दिखा रहे हैं. कोशिका विभाजन पर, वयस्क स्टेम कोशिकाओं आत्म नवीकरण और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का उत्पादन है कि बारी में वृद्धि अलग विभेदित संतानों के लिए दे सकते हैं करने में सक्षम हैं. मार्ग है कि ऊतक ¹ homeostasis में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका की वजह से सेल भाग्य का निर्णय और वयस्क स्टेम सेल की शक्ति को विनियमित समझ में बहुत रुचि है . उदाहरण के लिए, कई वैज्ञानिकों वर्तमान संकेत है कि अपने आला में विभिन्न वयस्क स्टेम सेल आबादी, या विशेष microenvironment, और कैसे इस जगह humoral कारकों से प्रभावित है को बनाए रखने की पहचान की तलाश है.

वयस्क hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) pluripotent कोशिकाओं है कि ^ईंधन 8 पशुओं में रक्त कोशिकाओं के नित्य कायाकल्प कर रहे हैं . Hematopoiesis एक जीवंत प्रक्रिया है कि एक हड्डीवाला जीव के जीवन के दौरान लगातार चल रही है क्योंकि परिपक्व विभेदित रक्त कोशिका प्रकार अल्पकालिक हैं और इसलिए नियमित रूप से मंगाया जाना चाहिए है. जैसा कि वे विभाजन, HSCs स्वयं renewing और progenitors कि erythroid, megakaryocyte, lymphoid और माइलॉयड प्रजातियों को जन्म दे की एक श्रृंखला का निर्माण करके इस महत्वपूर्ण मांग की आपूर्ति. इन रक्त कोशिका प्रकार के प्रत्येक संचलन में ऊतकों को गैस विनिमय प्रदान करने, रक्त वाहिकाओं के लिए थक्का बनने का मतलब है, या हमलावर रोगजनकों के खिलाफ रक्षा तंत्र द्वारा चोटों को सील करने के लिए एक तरीका सहित अद्वितीय कार्य करता है. जबकि HSCs कई वर्षों के लिए मान्यता दी गई है, आकर्षक सवालों के एक ढेर सारे इन अद्भुत कोशिकाओं के बारे में अनुत्तरित रह. हाल के अध्ययनों से अलग दीर्घकालिक आत्म नवीकरण, गुण, और आला उपकरणों और संकेत है कि ^HSC 8 व्यवहार मिलाना की व्याख्या के साथ HSCs की उपवर्गों की पहचान की है. zebrafish hematopoiesis अनुसंधान मानदंड के cornerstones के बीच अब इस ^पशु 8 मॉडल की आनुवंशिक और आणविक विशेषताओं पर आधारित है. Zebrafish उपयोग अनुसंधान HSC जीव विज्ञान के बारे में उपन्यास अंतर्दृष्टि है कि स्तनधारियों की तरह उच्च रीढ़ के साथ संरक्षित कर रहे हैं, मछली ^रक्त जांच 8 की जैव चिकित्सा प्रासंगिकता पर बल करने के लिए नेतृत्व किया गया है.

ऐतिहासिक, HSCs के बारे में ज्ञान पता चलता है कि शरीर के अन्य अंगों में वयस्क स्टेम सेल द्वारा रखा जाता है की मांग अभियानों के लिए रास्ता प्रशस्त किया है. कई वयस्क स्टेम सेल आबादी अब मौजूद सराहना कर रहे हैं, विविध संरचनाओं भर में मस्तिष्क से आंत, त्वचा, और कंकाल की मांसपेशी को लेकर. स्टेम सेल के क्षेत्र में निरंतर प्रयासों की पहचान करने के लिए कैसे वयस्क स्टेम सेल और अन्य विभेदित सेल प्रकार विभिन्न सेटिंग्स में बढ़ाया शक्ति प्रदर्शित कर सकते हैं चाहते हैं.

गुर्दे के लिए सम्मान के साथ, वहाँ के रूप में कि क्या गुर्दे की स्टेम ^{कोशिकाओं} मौजूद 16 nephrologists के बीच काफी बहस कर दिया गया है. स्वतंत्र निष्कर्ष है कि पुनर्योजी क्षमता की डिग्री बदलती के अधिकारी स्तनधारियों में गुर्दे की कोशिकाओं की आबादी की प्रलेखित है, लेकिन इन रिपोर्टों की एक जोड़नेवाला समझ अभी तक प्राप्त किया जा. दिलचस्प है, वहाँ मजबूत धारणा है कि कई मछली प्रजातियों कोशिकाओं है कि robustly क्षतिग्रस्त नेफ्रॉन के उत्थान ईंधन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ^कर सकते हैं 9 वयस्कता के दौरान पूरी तरह से नया नेफ्रॉन बढ़ने के अधिकारी के समर्थन में सबूत है. हाल ही में काम ^10,11 zebrafish में वयस्क गुर्दे स्टेम कोशिकाओं के आणविक पहचान की पहचान की है, और इन तथाकथित गुर्दे स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं ^(RPCs) 11 आत्म नवीकरण की शक्ति का प्रदर्शन किया. भविष्य के अध्ययन पता लगाने के लिए कि क्या अनुरूप गुर्दे की कोशिकाओं स्तनधारियों में मौजूद हैं की जरूरत है. फिर भी, सेलुलर और आणविक तंत्र है कि मछली RPCs को विनियमित के बारे में जारी जांच कैसे पुनर्योजी feats स्तनधारी गुर्दे में प्रेरित किया जा सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है. यह स्पष्ट है कि बहुत RPCs के बारे में समझा जा रहता है, और कई अब zebrafish शोधकर्ता के लिए उपलब्ध उपकरणों के लिए इन पेचीदा सवालों से निपटने के लागू किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल में, हम संरचनात्मक और वयस्क zebrafish गुर्दे की पहचान विच्छेदन के लिए हमारी पद्धति का वर्णन. वैकल्पिक कदम के लिए एक उदर विच्छेदन कैंची का उपयोग चीरा उदर गुहा के साथ खोलने जैसे गुर्दे, टुकड़े करना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, हम पूरे गुर्दे तक पहुँचने जब पेट की दीवार खुला टिकी है और सिर हटा दिया जाता है में सबसे अधिक सफलता का सामना करना पड़ा है. रक्त और गुर्दे की समान शोधकर्ताओं जो अलग है और इन प्रकार की कोशिकाओं के साथ काम करना चाहते हैं या तो विच्छेदन विधि का उपयोग कर सकते हैं. यह ध्यान दिया जाना चाहिए चाहिए कि हम अलग और काम करने के लिए विधि का वर्णनzebrafish वयस्क गुर्दे के साथ जी निश्चित रूप से वैज्ञानिकों ने वयस्क स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के प्रश्नों का पीछा करने के लिए, इस अंग के विच्छेदन के रूप में उन शरीर क्रिया विज्ञान से लेकर उम्र बढ़ने के लिए विषयों पर जांच का पीछा शोधकर्ताओं के लिए अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं इच्छा तक सीमित नहीं है. इसके अलावा, इस पद्धति ट्रांसजेनिक्स जैसे अन्य प्रौद्योगिकियों के साथ युग्मित किया जा सकता है, molecularly इतनी के रूप में और फिर लेबल शुद्ध और wildtype या ^{आनुवंशिक} उत्परिवर्ती 11 zebrafish से खून या गुर्दे की कोशिकाओं के असतत उप – जनसंख्या अध्ययन. आगे देख रहे हैं, ऐसे स्टेम और पूर्वपुस्र्ष सेल प्रकार के विस्तृत शुद्धीकरण प्रक्रियाओं कैसे उनके व्यवहार नियंत्रित किया जाता है के बारे में प्राप्त ज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में प्रत्यारोपण या पूर्वज संवर्धन के रूप में परिचालन परीक्षण के आधार गठन के द्वारा जो शक्ति और इन कोशिकाओं की पहचान में परिभाषित किया गया है. Hematopoietic पूर्वपुस्र्ष संस्कृति तरीकों में हाल के अग्रिमों के अध्ययन के लिए कई नए रास्ते खोल, और गुर्दे की ¹⁷ आबादी के संवर्धन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. Zebrafish रासायनिक आनुवंशिकी मार्ग है कि HSCs और विभिन्न ^18-20 संदर्भों में गुर्दे progenitors मिलाना, और ऊपर कोशिका जीव विज्ञान तकनीक के साथ संयोजन में परीक्षण के लिए एक उपयोगी अवसर हो करने के लिए जारी रहेगा की पहचान करने में सफल रहा है. साथ में ले ली, रुधिर विज्ञान और नेफ्रोलॉजी के क्षेत्र zebrafish मॉडल का उपयोग कर करने के लिए groundbreaking के योगदान की एक संख्या है, और इन Arenas में अनुसंधान जारी रखा, आने वाले वर्षों में फिराना आगे परिवर्तनकारी अंतर्दृष्टि का वादा किया है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Dissection scissors	Roboz	RS-5882
Dissection forceps	Roboz	RS-5010
Dissection angled forceps	Roboz	RS-5058
Tricaine	Sigma	E10521
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	19210