Bromodeoxyuridine (BrdU) التوسيم والفرز وبعد الإسفار خلية المنشط للتحديد ، ثقافة مستقلة عن العضوية الذائبة الكربون المهينة العوالق البكتيرية
Summary
يتم تحضين العوالق البكتيرية البيئية مع نموذج حل الكربون العضوي (DOC) المركب ووضع العلامات كاشف الحمض النووي ، bromodeoxyuridine (BrdU). بعد ذلك ، يتم فصل الخلايا DOC – المهينة الجزء الأكبر من المجتمع على أساس إدماجها BrdU مرتفعة باستخدام الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS). ثم يتم تحديد هذه الخلايا الجزيئية تحليلات لاحقة.
Abstract
الميكروبات وكلاء كبرى تتوسط في تدهور العديد من الكربون العضوي المذاب (DOC) ركائز في البيئات المائية. ومع ذلك ، وتحديد الأنواع البكتيرية التي تحول تجمعات محددة من DOC في الطبيعة يشكل تحديا تقنيا.
نحن هنا وصف نهج الأزواج bromodeoxyuridine (BrdU) التأسيس ومضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) ، و16S الرنا الريباسي الجينات الجزيئية التحليل القائم على الثقافة التي تسمح بتحديد مستقلة قادرة على العوالق البكتيرية المهينة مجمع DOC محددة في البيئات المائية. يتم تعيين عوالم مصغرة العوالق البكتيرية ثلاث نسخ لتلقي كل من BrdU ومجمع DOC طراز (DOC التعديلات) ، أو BrdU فقط (عدم التحكم بالإضافة إلى ذلك). بدائل يمكن BrdU مواقف ثيميدين في الحمض النووي البكتيري توليفها BrdU حديثا والتي تحمل علامات الحمض النووي يمكن 1،2 immunodetected بسهولة. العوالق البكتيرية من خلال 24 ساعة ، حضانة التي تكون قادرة على استخدام ويتوقع المجمع DOC أضاف تفعيلها بشكل انتقائي ، وبالتالي ارتفاع مستويات التأسيس BrdU (خلايا مرحبا) من غير استجابة الخلايا في التعديلات DOC والخلايا في عدم بالإضافة إلى ذلك الضوابط (انخفاض خلايا BrdU التأسيس ، وخلايا LI). بعد مضان مناعي ، وتتميز الخلايا مرحبا وفصلها ماديا من الخلايا التي LI مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) 3. يتم استخراج فرز DOC التي تستجيب الخلايا (خلايا مرحبا) لتحديد الحمض النووي وتصنيفيا عن طريق الجينات 16S الرنا الريباسي اللاحقة المستندة إلى تحليلات بما PCR ، استنساخ بناء مكتبة والتسلسل.
Protocol
Discussion
نهجنا إدماج BrdU الأزواج ، وFACS 16S rDNA تحليل للسماح الأنواع على مستوى تحديد الهوية من العوالق البكتيرية التي استقلاب العناصر الفردية DOC في البيئات المائية. في مقايسة التأسيس BrdU التسميات الخلايا البكتيرية على أساس الأنشطة الأيضية ، والذي يسمح فقط على تحليل البكتيريا النش…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل لهذا المشروع الوطني للعلوم OCE1029607 منح مؤسسة (لXM) وMCB0702125 (لمام) وغوردون وبيتي مور مؤسسة (لمام).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |
References
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).
- Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater. Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).
- Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).
- Dinjens, W. N. Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion. Histochemistry. 98, 199-199 (1992).
- Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR. Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).
- Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells. Science. 243, 1360-1360 (1989).
- Artursson, V., Jansson, J. K. Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).
- Mou, X. Z. Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean. Nature. 451, 708-708 (2008).
- Mou, X. Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).
- Dean, F. B. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).
