Bromodeoxyuridine (BrdU) लेबल और बाद प्रतिदीप्ति संस्कृति - स्वतंत्र भंग कार्बनिक की पहचान के लिए सक्रिय सेल छंटनी कार्बन अपमानजनक Bacterioplankton
Summary
पर्यावरण bacterioplankton एक मॉडल भंग कार्बनिक कार्बन यौगिक (doc) और एक डीएनए लेबलिंग अभिकर्मक, bromodeoxyuridine (BrdU) के साथ incubated हैं. उसके बाद, डॉक्टर अपमानजनक कोशिकाओं थोक उनके बुलंद BrdU प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग समावेश पर आधारित समुदाय से अलग कर रहे हैं. इन कोशिकाओं को फिर बाद में आणविक विश्लेषण के द्वारा पहचाने जाते हैं.
Abstract
रोगाणुओं प्रमुख कई भंग कार्बनिक (doc) जलीय वातावरण में कार्बन substrates की गिरावट mediating एजेंट हैं. हालांकि, बैक्टीरियल taxa है कि प्रकृति में डॉक्टर की विशिष्ट ताल को बदलने की पहचान एक तकनीकी चुनौती बन गया है.
यहाँ हम एक दृष्टिकोण का वर्णन है कि जोड़ों bromodeoxyuridine (BrdU) निगमन, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS), और rRNA जीन के आधार पर आणविक विश्लेषण है कि अपमानजनक जलीय वातावरण में एक विशिष्ट डॉक्टर परिसर में सक्षम bacterioplankton की संस्कृति स्वतंत्र पहचान की अनुमति देता है -16. तीन प्रतियों bacterioplankton लघु सेट कर रहे हैं दोनों BrdU और एक मॉडल डॉक्टर यौगिक (डॉक्टर संशोधनों), या केवल BrdU (नियंत्रण नहीं के अलावा) प्राप्त. BrdU substitutes के नव संश्लेषित जीवाणु के डीएनए और BrdU – लेबल डीएनए में thymidine की स्थिति आसानी से immunodetected 1,2 जा सकता है . एक ऊष्मायन 24 घंटा bacterioplankton, कि का उपयोग करने के लिए जोड़ा डॉक्टर मिश्रित करने के लिए चुनिंदा सक्रिय होने की उम्मीद कर रहे हैं, और इसलिए नहीं – BrdU निगमन के उच्च स्तर (हाई कोशिकाओं) डॉक्टर संशोधन और कोशिकाओं में गैर जिम्मेदार कोशिकाओं की तुलना में है के लिए कर रहे हैं के माध्यम से इसके अलावा नियंत्रण (कम BrdU समावेश कोशिकाओं, लाइट कोशिकाओं). प्रतिदीप्ति immunodetection के बाद, हाय कोशिकाओं प्रतिष्ठित और शारीरिक रूप से प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) 3 द्वारा लाइट कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं. क्रमबद्ध करें डॉक्टर उत्तरदायी कोशिकाओं (हाई सेल) डीएनए के लिए निकाले जाते हैं और taxonomically पीसीआर, क्लोन पुस्तकालय निर्माण और अनुक्रमण सहित बाद -16 rRNA जीन के आधार पर विश्लेषण के माध्यम से की पहचान की है.
Protocol
Discussion
हमारे दृष्टिकोण जोड़े BrdU समावेश FACS, और rDNA विश्लेषण -16 प्रजाति स्तर bacterioplankton है कि जलीय वातावरण में व्यक्तिगत डॉक्टर घटकों metabolize की पहचान करने की अनुमति. BrdU समावेश परख बैक्टीरियल कोशिकाओं चयापचय गतिविधियों, ज?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना के अनुदान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (XM के लिए) OCE1029607 और MCB0702125 (mam के लिए) और गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन (mam के लिए) द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |
References
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