Bromodeoxyuridine (BrdU) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 Bacterioplankton
Summary
환경 bacterioplankton는 유기 탄소 (DOC) 화합물과 DNA 라벨 시약, bromodeoxyuridine (BrdU)를 해산 모델 incubated 있습니다. 그 후, DOC – 굴욕적인 세포는 형광 활성 세포 분류 (외과)를 사용하여 고가 BrdU의 설립에 따라 대량 지역 사회에서 분리됩니다. 이러한 전지는 다음 이후의 분자 분석에 의해 식별됩니다.
Abstract
미생물이 수중 환경에서 다수의 용해 유기 탄소 (DOC) 기판의 저하를 중재 주요 수단이된다. 그러나, 자연 DOC의 특정 풀을 변형 박테리아 taxa의 식별은 기술적인 도전을 포즈.
여기서 우리는 접근 방식을 설명하는 것을 커플 bromodeoxyuridine (BrdU) 정관, 형광 활성 세포 분류 (외과), 그리고 16 수생 환경에서 굴욕 특정 DOC 화합물 가능한 bacterioplankton 문화 독립적인 식별이 가능 rRNA 유전자 기반의 분자 분석. 세중의의 bacterioplankton의 microcosms은 BrdU와 모델 DOC 화합물 (DOC 개정) 또는 전용 BrdU (노 또한 컨트롤)를 모두 받도록 설정되었습니다. 새로 합성된 박테리아 DNA와 BrdU – 라벨 DNA의 thymidine의 BrdU의 대용품이 순위는 쉽게 immunodetected 1,2 수 있습니다. 추가 DOC 화합물을 선택적으로 활성화 될 것으로 예상하고, 따라서에서 노 DOC의 개정과 세포에 비 응답 전지보다 BrdU의 설립 높은 수준의 (HI 세포)를 가지고 있습니다 사용할 수 있습니다 24 시간 보육, bacterioplankton 통해 또한 컨트롤 (낮은 BrdU의 설립 세포, LI 전지). 형광 면역 후, HI 전지는 구별하고 육체적으로 형광 활성 세포 분류 (외과) 3 LI 세포 분리. 정렬 DOC – 반응 전지 (HI 세포)의 DNA가 추출 taxonomically PCR, 클론 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 포함하여 rRNA 유전자 기반의 분석 이후 16를 통해 식별됩니다.
Protocol
Discussion
우리의 접근 커플 BrdU의 설립, 외과 및 16 rDNA 분석 수생 환경에서 개별 DOC 구성 요소를 대사 bacterioplankton의 종 수준의 식별을 허용합니다. BrdU의 설립 분석은 활성 세균에 대한 분석이 가능하기 때문에 휴면 세포를 포함하지 않습니다 신진 대사 활동을 기반으로 박테리아 세포를 표시합니다. 우리의 접근에서 BrdU의 설립은 이후 시각 아르 BrdU의 설립의 다른 수준을 가지고 immunodetected 현장과 박?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트의 자금은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 부여 OCE1029607 (XM)을하고 MCB0702125 (MAM)을하고 고든과 베티 무어 재단 (MAM)을 제공한했습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |
References
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).
- Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater. Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).
- Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).
- Dinjens, W. N. Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion. Histochemistry. 98, 199-199 (1992).
- Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR. Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).
- Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells. Science. 243, 1360-1360 (1989).
- Artursson, V., Jansson, J. K. Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).
- Mou, X. Z. Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean. Nature. 451, 708-708 (2008).
- Mou, X. Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).
- Dean, F. B. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).
