ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine Sensor eiwitten in cellen
Summary
De biarsenical kleurstoffen Flash en ReAsH binden specifiek aan tetracysteine motieven in eiwitten en kan selectief label eiwitten in levende cellen. Onlangs is dit de etikettering strategie is gebruikt om sensoren voor verschillende eiwitten conformaties of oligomere staten te ontwikkelen. Beschrijven we de etikettering van aanpak en methoden om kwantitatief te analyseren bindend.
Abstract
Fluorescerende eiwitten en kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor de studie van proteïne mensenhandel, lokalisatie en functie in cellen. Terwijl fluorescerende eiwitten zoals groene fluorescentie eiwit (GFP) zijn uitgebreid gebruikt als fusiepartners om eiwitten aan de eigenschappen van een eiwit van belang een, recente ontwikkelingen track met kleinere labels in staat stellen nieuwe functionaliteiten van eiwitten worden onderzocht in cellen, zoals conformationele verandering en eiwit-vereniging 2, 3. Een kleine tag-systeem omvat een tetracysteine motief (CCXXCC) genetisch ingebracht in een doelwit eiwit, dat bindt aan biarsenical kleurstoffen, ReAsH (rood fluorescerend) en Flash (green fluorescent), met een hoge specificiteit, zelfs in levende cellen 2. De TC / biarsenical dye-systeem biedt veel minder sterische beperkingen op de host eiwit dan fluorescerende eiwitten die in staat heeft gesteld een aantal nieuwe benaderingen van conformationele verandering en eiwit-eiwit interacties 4-7 te meten. We hebben onlangs een nieuwe toepassing van TC tags als sensoren van oligomerisatie in cellen die mutant huntingtine, die, wanneer gemuteerd aggregaten in neuronen in de ziekte van Huntington 7. Huntingtine werd getagd met twee fluorescente kleurstoffen, een een fluorescerend eiwit bewerkt om locatie volgen, en de tweede een TC-tag die alleen biarsenical kleurstoffen bindt in monomeren. Vandaar dat veranderingen in de colocalization tussen eiwit en biarsenical kleurstof reactiviteit ingeschakeld submicroscopische oligomeer inhoud ruimtelijk in kaart worden gebracht in de cellen. Hier beschrijven we hoe de TC-gemerkte eiwitten gefuseerd met een fluorescerend eiwit (Cherry, GFP of GVB) met Flash of ReAsH in levende zoogdiercellen en hoe je de twee kleuren fluorescentie (Cherry / Flash, GVB / Flash of GFP / kwantificeren label ReAsH combinaties).
Protocol
Discussion
De aanpak van label eiwit lokalisatie met een fluorescerend eiwit en conformationele eigenschappen met een tweede kleurstof biedt veel mogelijkheden voor in kaart brengen van waar verschillende conformaties van eiwitten opbouwen in cellen en evenementen die de dynamiek van eiwit conformatie te veranderen. ReAsH / Flash werd voor het eerst gebruikt als een in-cel-sensor voor het vouwen van eiwitten van de zoogdieren cellulaire retinoïnezuur-bindend eiwit I 4. In dit voorbeeld is de FLASH gebonden aan een TC t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan DMH en TDM (NHMRC projectsubsidies). DMH is een Grimwade Fellow, gefinancierd door de Miegunyah Trust.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
