ReAsH / फ्लैश लेबल और Tetracysteine सेंसर प्रोटीन के कक्ष में छवि विश्लेषण
Summary
biarsenical रंजक फ्लैश और ReAsH प्रोटीन में tetracysteine रूपांकनों के लिए विशेष रूप से बाँध और चुनिंदा जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन लेबल कर सकते हैं. हाल ही में इस लेबलिंग रणनीति अलग प्रोटीन रचना या oligomeric राज्यों के लिए सेंसर विकसित इस्तेमाल किया गया है. हम लेबलिंग दृष्टिकोण का वर्णन और विधियों मात्रात्मक बंधन का विश्लेषण करने के लिए.
Abstract
प्रतिदीप्त प्रोटीन और रंजक प्रोटीन की तस्करी, और कोशिकाओं में स्थानीयकरण समारोह के अध्ययन के लिए आवश्यक उपकरण हैं. जबकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) जैसे बड़े पैमाने पर किया गया है प्रोटीन के लिए संलयन भागीदार के रूप में इस्तेमाल करने के लिए छोटे टैग प्रोटीन के नए functionalities सक्षम गठनात्मक परिवर्तन जैसे कोशिकाओं में जांच की जानी के साथ 1 ब्याज की एक प्रोटीन है, हाल के घटनाक्रम के गुणों को ट्रैक और प्रोटीन संघ 2, 3. एक छोटे टैग प्रणाली tetracysteine (CCXXCC) आकृति आनुवंशिक रूप से एक लक्ष्य प्रोटीन है, जो biarsenical रंगों बांध में डाला शामिल है, ReAsH (लाल फ्लोरोसेंट) और (हरे रंग का फ्लोरोसेंट) जीवित कोशिकाओं 2 में भी उच्च विशिष्टता के साथ, फ्लैश. टीसी / biarsenical डाई प्रणाली फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जो कई नए दृष्टिकोण सक्षम है गठनात्मक परिवर्तन और प्रोटीन, प्रोटीन 4-7 बातचीत उपाय की तुलना में कहीं कम steric मेजबान प्रोटीन की कमी प्रदान करता है. हम हाल ही में oligomerization के उत्परिवर्ती huntingtin व्यक्त कोशिकाओं में सेंसर के रूप में टीसी टैग के एक उपन्यास आवेदन विकसित जो जब हटिंगटन रोग 7 में न्यूरॉन्स में उत्परिवर्तित समुच्चय. Huntingtin दो फ्लोरोसेंट रंजक, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रोटीन स्थान को ट्रैक करने के लिए, और दूसरा एक टीसी टैग जो केवल monomers में biarsenical रंजक बांध के साथ टैग किया गया था. इसलिए, प्रोटीन और biarsenical डाई जेट के बीच colocalization में परिवर्तन submicroscopic oligomer सामग्री सक्षम करने के लिए spatially कोशिकाओं के भीतर मैप किया जा. यहाँ, हम वर्णन कैसे टीसी टैग फ़्लैश या ReAsH जीवित स्तनधारी कोशिकाओं में और कैसे दो रंग प्रतिदीप्ति (चेरी / फ्लैश, CFP / फ़्लैश या GFP / यों के साथ एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चेरी GFP, या CFP) के लिए जुड़े हुए प्रोटीन लेबल ReAsH संयोजनों).
Protocol
Discussion
एक फ्लोरोसेंट और एक दूसरे रंग के साथ प्रोटीन गठनात्मक गुणों के साथ लेबल प्रोटीन स्थानीयकरण करने के लिए दृष्टिकोण बहुत मानचित्रण जहां कोशिकाओं और घटनाओं है कि प्रोटीन की रचना की गतिशीलता को बदल में प्…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम DMH और TDM (NHMRC परियोजना अनुदान) अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. DMH Grimwade फैलो, Miegunyah ट्रस्ट द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
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