Biarsenical красителей вспышкой и ReAsH специфично связываются с tetracysteine мотивов в белках и может выборочно этикетке белков в живых клетках. В последнее время эта маркировка стратегия была использована для разработки датчиков для различных конформаций белков или олигомерных государств. Мы описываем маркировки подход и методы количественного анализа связывания.
Флуоресцентные белки и красителей являются необходимыми инструментами для исследования белков торговли людьми, локализации и функции в клетках. Хотя флуоресцентные белки, такие как зеленая флуоресценция белка (GFP), широко использовались в качестве партнеров для слияния белков отслеживать свойства белка интересов 1, последние события с меньшей теги позволяют новых функциональных белков должны быть рассмотрены в клетках, таких как изменение конформации и белково-ассоциации 2, 3. Одна маленькая система включает в себя теги tetracysteine мотив (CCXXCC) генетически вставляется в целевой белок, который связывается с biarsenical красители, ReAsH (красный флуоресцентный) и Flash (зеленый флуоресцентный), с высокой специфичностью даже в живые клетки 2. TC / biarsenical красителя система предлагает гораздо меньше стерических ограничений на хост белка, чем флуоресцентные белки, что позволило несколько новых подходов для оценки конформационных изменений и белок-белковых взаимодействий 4-7. Недавно мы разработали новое применение ТК теги как датчики олигомеризации в клетках, экспрессирующих мутантный Huntingtin, который при мутировал агрегатов в нейронах в Хантингтон болезни 7. Huntingtin была помечена с двумя флуоресцентными красителями, один флуоресцентный белок отслеживать местоположение белка, а второй теги TC которые только связывает biarsenical красителей в мономеров. Следовательно, изменения в колокализации между белком и biarsenical красителя реактивность включен субмикроскопических содержание олигомеров быть пространственно отображается внутри клеток. Здесь мы опишем, как этикетка TC-меткой белков, слитый с флуоресцентный белок (вишня, GFP или CFP) со вспышкой или ReAsH в живых клетках млекопитающих и как количественно два цвета флуоресценции (вишня / Flash, CFP / Flash или GFP / ReAsH комбинации).
Подход к этикетке локализации белка с флуоресцентным белком и конформационные свойства со вторым красителем предлагает большой потенциал для отображения, где разные конформации белков накапливаются в клетках и события, которые изменяют динамику конформации белка. ReAsH / Flash был впервы…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась за счет грантов для ДМГ и TDM (NHMRC проекту гранты). ДМГ является Гримвад сотрудник, финансируемый Miegunyah Trust.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |