バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

Summary

我々は包括的、公平なゲノムワイドな遺伝子薬剤と遺伝子 – 環境相互作用を理解するために画面を開発しました。これらの変異体のコレクションをスクリーニングするための方法が提示されます。

Abstract

次世代シーケンシング技術の進歩のおかげで、我々は、ほぼ毎日新しいゲノム配列へのアクセス権を持っている。これらの進歩のテンポがより大きな深さと幅広さを約束し、加速しています。これらの飛躍的進歩を踏まえて、遺伝子の機能を定義するために、高速、並​​列メソッドの必要性がますます重要になります。酵母やE.におけるゲノムワイドな欠失変異体のコレクション大腸菌の遺伝子の機能の機能解析のための主力を務めているが、この方法はスケーラブルではない、現在の遺伝子欠失のアプローチは、ゲノムを構成する数千の遺伝子のそれぞれを削除し、検証する必要があります。この作業が完了した後にのみ、我々は、高スループットの表現型解析を挟むこともできます。過去10年間で、私たちの研究室では競争力のある、小型化、ハイスループットのゲノムワイドな並列実行できるアッセイのポートフォリオを改良しました。この並列化では、バーコードは、突然変異のプロキシとして機能しているためDNA"タグ"、または各変異体に"バーコード"を含めることが可能であり、1は変異型フィットネスを評価するためにバーコードの存在量を測定することができます。本研究では、我々はDNA配列やバーコード変異体コレクションの間のギャップを埋めるために求めている。これを達成するために我々は、新たに配列決定するまでのパラレルバーコードのアッセイを開きますが、悪い微生物を特徴とする複合トランスポゾン混乱 – バーコードのアプローチを紹介する。我々は新しいカンジダバーコード混乱のコレクションを発表し、どのように両方のマイクロアレイベースの、次世代シーケンシングベースのプラットフォームを記述するこのアプローチを説明するために10,000を集めるために使用することができます-一回の実験で1,000,000遺伝子-遺伝子と薬剤遺伝子の相互作用。

Protocol

1。背景情報バーコードタグを運ぶ変異体を生成するには、いくつかの方法があります。現在のゴールドスタンダードは、ラボのコンソーシアムによって作成され、2002年1年に完成した酵母のノックアウト（YKO）コレクションです。オリジナルYKOが導入されて以来、他の酵母のコレクションが生成されている。異なる菌株の背景に、過剰発現構築物を使用して、そしてそのようなEと他の微生物に大腸菌 2。並行して、バーコードshRNAライブラリを作成するための努力が急速に進んでおり、そして実際に、これらの哺乳類のコレクションのための設計原理の多くは、酵母から採用されている。バーコードトランスポゾンは、体系的変異体のコレクションを作成するための迅速、広範囲に適用可能な戦略となることができる方法を示すために、我々は最近、人間の真菌病原体、 カンジダアルビカンスで作成したコレクションに焦点を当てる。カンジダについて私たちの仕事はS.でバーコード画面の成功に基づいていた出芽酵母 、および例の生物としてここで使用されています。サンプルプロトコルは、マイナーな修正を加えて懸濁培養で成長させることができる任意の生物をスクリーニングするために使用することができます。いくつかの生物は、変換の必要な高い率と完全な欠失変異体を作成するために必要な効率的な有糸分裂組換えを持っているので、それに応じて我々は、ゲノムDNAライブラリーを突然変異を起こさせるためにin vitroでトランスポゾン突然変異誘発を使用するプロトコルを開発し、Candida albicansの 3にこれらのバーコードゲノム断片を変換、4。オリジナルYKOコレクションの成功に触発され、遺伝子ネットワークの性質についての基本的な発見で、その役割5-8、ゲノムワイドなハプロ不全9、創薬ターゲットとアクション10,11のメカニズム、及びゲノムの全遺伝子の本質我々は他の微生物にこのアプローチを拡大する予測12は、非常に実りあるでしょう。 以下のプロトコルは、所望の変異は、コレクションの作成 ​​（例：YKOまたはカンジダ混乱のコレクション）と個別にアーカイブされた菌株として利用してしていることを前提としています。ひずみ建設の詳細な説明については1,13,14を参照してください。 2。単一のプールに個々の変異体を組み合わせる一週間は、プールされた細胞のアリコートを（-80 ​​° Cで無期限に保存できる）を生成することができます。 完全に興味のある株について凍結グリセロールストックを融解が、細胞が> 2時間のために解凍のままさせてください。 2 70％エタノール浴中のディップ（例えばピペットチップボックスの蓋）、火炎ピンのツールと​​1分間クールに続いて96ウェルピンツール、残りの細胞を除去するために水でピンツールを浸漬し、滅菌する。ピンツール離れてエタノール浴から炎に注意してください。エタノール浴のレベルは、すべてのキャリーオーバー細胞が燃え上がると削除されるように、水浴中でレベルを上回っている必要があります。すべての4〜6 pinningsは、水を交換してください。 軽く解凍した96ウェルプレート、スワールに滅菌96ウェルピンのツールを挿入し、適切な抗生物質を含むYPD寒天を含むヌンクオムニトレイにセルを転送する。彼らは30 ° C（2 – 3D）で最大サイズに達するまでコロニーを生育させます。プレートを節約するために、我々は、〜384株で、単一のオムニトレイに4枚の96ウェルプレートを統合することが最も便利です。 コロニーが成長した後、万一、不足や成長の遅い株のことに注意してくださいとでこれらをレーピン〜株の残りの部分として、細胞塊を2倍。 微生物の環境（炎と無菌実験機器と、5〜10 mlのメディアとの洪水のプレートでの作業、セルスプレッダーで5分間再懸濁しますコロニーを浸す。50 mlコニカル遠心チューブに液体を加えた細胞を注ぎ、とにグリセロールを追加する7％から15％DMSO（vol / vol）の。 プールのOD 600を測定し、15％グリセロールまたは7％のDMSOを含む培地で50 OD 600 / mlの最終濃度に（希釈または遠心分離によって）調整する。 -80℃でPCRストリップチューブや凍結で40μlの量で分注し℃に 3。実験的なプールの成長この手順は、 図1で概説されます。 氷上で解凍プールのアリコート（PCRチューブで）。ロボットを使用していない場合、手順5に進みます。 すぐに48ウェルプレートに700μlの総体積で0.0625のOD 600で接種、薬剤または選択の状態とメディアへ（gently!）プールを希釈する。プレート上の少なくとも1つの適切な溶媒コントロールが含まれています。 （よく1より大きい値をすなわち）成長の5世代を超えて拡張実験のために、隣接するメディアまたは選択の条件と井戸が、NOの細胞を埋める。 プラスチック製のプレートシールでシール、条件は好気性の成長（例えば、非発酵性炭素源を）必要とする場合、各ウェルの側に向かって膜のシールでピアスの穴に21ゲージ針を使用。 実験的にdetermiで30℃で振盪、分光光度計で成長するNEDが揺れレジメン（例えば揺れ再開、最高の設定（または温度制御シェーカー）、読み取り井戸で14分を横に振る）。細胞懸濁液の一部は、ユーザー定義の生成時のポイントは、通常5、10、15と成長の20世代でロボット甲板上でコールドプレート上にロボットが収穫して保存することができます。 （詳細はお問い合わせC. NislowまたはG.イェーヴァー用http://med.stanford.edu/sgtc/technology/access.html、）。 手動の細胞増殖のために、250mlの培養フラスコに0.002の開始OD 600で50 mlの培養液に接種する。細胞が成長の〜10世代のために2.0の最終OD 600を （ サッカロマイセスまたはカンジダ用）に到達するまで、250 rpmで30℃で振とうする。成長の追加の世代には新鮮なフラスコに0.02に戻って2.0のOD600で希釈細胞によって得ることができます。 セイフ-ロックのマイクロチューブに各サンプル/時間ポイントのための細胞の約2 OD 600単位以上の収穫。 注：必ず、説明したように1.5 mlチューブや処理に直接冷凍庫のアリコートからプール1-2 OD 600を追加することで、新しく作成されたプール内の初期ひずみの表現を評価するための出発細胞サンプル（例："T0の時点"）を収集以下に。 4。ゲノムDNA抽出、PCRやマイクロアレイハイブリダイゼーションまたはシーケンシング （議定書私は酵母のDNAを使用している場合）、または関心の生物（固有の別の適当な方法アルコール沈殿が続く標準のフェノール/クロロホルム抽出の仕組みは、メーカーの指示に従ってZymo研究YeaStarキットを用いて細胞のOD 600〜2からゲノムDNAを精製するよく多様な微生物のため）。 YeaStarキットを使用している場合、プロトコルで指定された1 × TE 60μLの代わりに、0.1 × TE300μlでDNAを溶出させる。ゲノムDNAは、-80℃で無期限に保存することができます。 33μLのddH 2 O、MgCl 2をせずに6μlの10 × PCR緩衝液、3μlの50mMのMgCl 2を 、1.2μL：次のように反応条件と、各サンプルに2つのPCR反応は、uptagsとdowntags用に一つずつを、設定する15μlの10 mMのdNTPsを、1.2μlの50μMUpまたはDownプライマーミックス、0.6μlの5 U /μlのTaqポリメラーゼ、〜0.1μgのゲノムDNA。総体積は60μlです。その後、72℃3分、そして4℃で保持℃、94℃で3分間、94 30サイクル° C 30秒、55℃30秒、72℃30秒：次の条件の下でThermocycleゲル上で得られたPCR産物をチェックし、両方のPCRのための60 bpの製品は、バーコードのシークエンシング用のアンプリコン）のためのハイブリダイゼーションおよび130bpのために使用されるアンプリコンのために期待されています。 PCR産物は、-80℃で無期限で保​​存することができる。 42〜Prewarmハイブリダイゼーションオーブンの温度℃、氷 – 水スラリーを含む沸騰水浴と氷のバケツを設定する。 徐々に120μlの1 ×ハイブリダイゼーション用緩衝液で充填してプリウェット配列。 42でハイブリダイゼーション緩衝液中でインキュベート℃、10分間20回転。 75μlの2Xハイブリダイゼーション緩衝液、0.5μlのB213コントロールのオリゴヌクレオチド（0.2 FM /μl）を、12μlの混合オリゴヌクレオチド（12.5分/μL）、μlの3を次のように、ハイブリダイゼーションサンプルあたりのミックスに加えて、バッファとして余分な1個の90μlを準備するロック上位0.5 mlチューブで50倍デンハルト溶液）。 150μLの全体積に対して120μlのハイブリダイゼーション混合物に、30μlのuptag PCRおよび30μlのdowntag PCRを追加。 2分間煮て、少なくとも2分間氷水に設定する。簡単に言えば、使用前にチューブをスピン。 配列からのプレハイブリダイゼーションバッファーを除去し、90μlのハイブリダイゼーション/ PCRミックスを追加してください。蒸発を防ぐために、タフスポットを持つ配列のガスケットをカバーしています。 42℃16時間ハイブリダイズ° C、20 rpmで。 次のようにたては、600サンプルごとμLビオチンラベリングミックスに加えて余分なものを準備します。180μlの20X SSPE、12μlの50Xデンハルト、6μlの1パーセントのTween 20（vol / vol）の、1μlの1 mg / mLのストレプトアビジン – フィコエリスリン、401μlをのddH 2 O暗闇の中ですべてのストレプトアビジン- PEのサンプルを保管してください。一定分量を2 mlのチューブに600μlの。チップからタフスポットを削除します。 ゆっくりとピペットで配列からハイブリダイゼーションミックスを削除し、120μlの洗浄A.内閣総理アフィメトリクス流体の駅でマイクロアレイを埋める。 （1サイクル、2ミックス）染色する前に、Bの温度42 ° Cの代わりを洗うウォッシュ1余分なステップ：次の点を変更"遺伝子Flex_Sv3_450"プロトコルを使用して、製造元の指示に従ってアフィメトリクス流体ステーションを使用してアレイを洗う40 ° C、° Cの代わりに25℃、42℃染色それは、（参照15頁396参照）後に手動でのハイブリダイゼーションの洗浄、ビオチンの染色、およびポスト染色の洗浄を行うことも可能です。流体操作の後、流体の駅"SHUTDOWN_450"プロトコルを実行してください。 洗浄に続いて、に気泡が存在していないことを確認してください。泡が消えるまでに必要なゆっくりと90μlの洗浄とピペットを追加した場合。いかなる商標またはSMがある場合アレイ表面上udgesは、イソプロパノールでガラス窓をきれいにし、糸くずの出ないティッシュ。ガスケット/セプタムを介して新鮮なタフスポットを適用すると、スキャナでのアレイを配置。 560nmの発光波長でアフィメトリクスGeneArrayスキャナでスキャン。 5。アレイ解析（Candida albicansの混乱のコレクションを使用して得られた例については、図2を参照） 外れ値のマスキング：アフィメトリクスTAG4の配列が含まれているので5がランダムにマスクして破棄することができます複製から逸脱するいかなるバーのプローブを分散した各バーコードの補体の複製。 4他のと比較して、その信号に基づいて、外れ値と思われる各配列の機能では、この機能を複製のためにこれを行うには、、当社のソフトウェアは、最初の容疑者で25の機能のマトリックスを生成する、疑わしい異常値を囲む5の機能を調べ、中央の機能。この地域の> 25分の13のプローブが10％以上彼らの個々の彼らのトリミングされた複製の平均値の各（中間にある三つの複製の平均値、複製最高と最低を除く）と異なる場合は、このプローブは、さらなる分析から破棄されます。そのような外れ値が最も頻繁にポストハイブリダイゼーションの洗浄の不整合の結果なので、疑わしいプローブを含む領域を、我々は展開したり、"パッド"。などで定義されている5 -プローブの半径内のすべてのプローブを含むことにより、パッドなどのプローブ、（（X 1 – X 2）2 +（Y 1 – Y 2）2）½ <6ここで、X 1、X 2、Y 1、およびY 2は、2つの機能のためのx座標とy座標です。最後に、標準機能のピクセル/機能のピクセルを平均の偏差（Affymetrix社のアレイ用の。CELファイルに含まれる）のための機能を捨てる。外れ値を除去した後、残りのすべての平均強度値は複製されます。 使用不能タグの削除：低強度の値でタグと低品質の結果が得られますし、削除する必要があります。これらの低強度のプローブの除外カットオフは、次のように計算できます。 配列の任意の治療制御のペアの場合は、I Cは制御の強さである、I Tは、治療の強さであり、aとb、それぞれのタグのためにログインする2（（ 私はC – B G）/（I T – B G））を計算gは割り当てられていないタグプローブの平均輝度です。 株によるuptagとdowntag比率をペアにし、それぞれのタグのペアに対して、2つのサンプルで二つのタグのための最小強度を取る。この最小強度が比のペアを並べ替えます。 ランク比率のペアで50のスライディングウィンドウのサイズを使用して、ウィンドウ内比率のペアをuptagとdowntagの相関を計算する。また、前の手順で計算された最小強度の平均値を計算する。 25ペアでウィンドウをスライドさせ、すべてのペアが交差されるまで、前の手順を繰り返します。 すべてのウィンドウでuptag – downtag相関対平均最小強度をプロットします。 最後に、強度のしきい値を選択して、一般的に我々は相関関係が最初にその最大レベルの80％に達する強度の値を使用してください。フラグとさらなる解析から、このカットオフより下のタグを削除。 彩度補正：バーコードマイクロアレイ上の各機能が飽和状態になる可能性があるため、TAG4アレイ上の信号が直線的にタグの濃度に関連していない。この飽和は、リファレンス16に記載のプロトコルに従うために修正する。 配列の正規化：各配列に対して、個別にuptagsとdowntagsを正規化する。正規化変位値に、増加する強さの順にuptagsとdowntags各配列から取得した値をランク付けする。 uptagsとdowntagsのセットごとに正規化を意味すると、平均値で割ります。すべてのアレイの平均正規化は、それぞれの配列の平均値に生データを変換する第二段階の次のようになります。 制御処理の比較のために感度のスコアを計算する：感度の指標としてログ2比を使用するには：それぞれの菌株については、ログに記録2（（μC – B G）/（μT – B g）を ）計算し、ここで、μcは対照サンプルの強度を意味し、μtは治療のサンプルの平均強度であり、aとbのgは割り当てられていないプローブの平均輝度です。ポジティブログ2比を有する株は、治療に敏感である、と耐性があるものは、負の対数2比を持っている。 6。シークエンシングによってバーコード酵母株の適応度の評価としてマイクロアレイのために説明する削除プールからDNAを分離する。 （イルミナプライマーとアンプリコンの図については、図3の表を参照）イルミナフローセルへのハイブリダイゼーションに必要な一般的なバーコードのプライマーの配列との配列から成る複合的プライマーを用いて、各20 – merのuptagのバーコードを増幅する。これらのプライマーは、追加の精製なしで脱塩に使用することができます。 PCRは、以下の条件でインビトロジェンプラチナPCRスーパーミックス（カタログ番号11306から016）を用いて、100μLで実行されます：95℃/ 3分、94の25サイクル° C/30秒、55℃C/30秒、68 ° C/30秒、68℃C/10分が続く。 キアゲンアプライ96 UF PCR精製キット（カタログ番号28051）でPCR産物（〜130bp）を精製する。 PCR精製に続いて​​、インビトロジェンクワント- ITのdsDNA BRアッセイキット（カタログ番号Q32853）でDNAを定量化する。 280分の260の測定値に依存しないようにしてください！ 正規化されたDNAの10μg/mlとプール等しいボリュームにDNA濃度を正規化する。 使用電圧に応じて3-4時間12％ポリアクリルアミドTBEゲル上で別のプールされたDNA。 30分間エチジウムブロマイド（SYBRグリーンも同様に動作するはずです）でゲルを染色する。 （適切な顔面保護を着用）長波長の紫外線ライトで目的のバンドを見つけ、それを切り出し、ときめきを使用してDNAを抽出し、エタノール沈殿に続く方法17を浸す。 適切なサイズのDNA（130bp）が分離され、そのプライマーは、アジレントバイオアナライザの高感度DNAキット（カタログ番号5067から4626）を使用して削除されていることを確認してください。 サンプルのシーケンシング： イルミナGAIIxプラットフォーム： CBOTとシングルリードクラスタ生成のキット（カタログ番号GD – 300 – 1001）を使用してシングルリードフローセル上でクラスタを生成する。リード1、UPおよびDOWN -タグは、配列決定用プライマーを変更するため100uMストック濃度でプールし、ストリップ、チューブ（120μlをHT1の各100uMシークエンシングプライマーの0.6μL）に追加されます。レシピSR_Amp_Block_StripTubeHyb_v7.0は、R1のクラスタを生成するために使用されます。 ゲノム解析IIxはオンシーケンス。 18シーケンスサイクルに続いて、ペアエンドモジュールは、イルミナR1を（下）を使用して、合成された第一鎖を除去し、フローセルをrehybridizeするために使用されます。クラスタを再生成し、インデックスタグをキャプチャするために5サイクルのために配列決定されています。 インデックスタグ配列は、実験的なビンにビンのシーケンスに使用されます。 各実験のビンの中で、酵母のバーコードシーケンスは、各バーコードのカウントの合計数を算出するために集計されます。 カウントは、それぞれの実験は、同じ数の分布を持つように正規化変位値です。バーコードマイクロアレイフィットネス実験、各菌株に対する適合の不良率から類推して、ログ2比（制御/治療）として計算して表現されます。肯定的なフィットネスの欠陥の点数は、薬物治療中のひずみの存在量の減少を意味し、その歪みに削除された遺伝子の野生型バージョンはその薬や阻害剤に対する耐性に必要であることを示唆している。 注：アレイハイブリダイゼーションの代替としてバー- seqを考慮。ハイスループットシーケンシングのコストは、タグの豊かさの読み出しとハイスループットシーケンシングを使用して、低下すると、実現可能な、多くの場合になってきている18、費用効率が向上します。このように、増幅されたPCR産物は、直接"カウント"としてではなくとして配列にハイブリダイズしたシグナルの強度として測定されます。これは、タグのクロスコンタミネーション、彩度、または非常に高いまたは非常に低い信号強度に起因する問題から生じる偽陰性と陽性を排除。さらに、複数の実験は4〜8塩基のDNAインデックス19の添加によりシーケンス処理の前に組み合わせることができます。酵母のバーコードが20 bpのなので、26から28塩基から読んで一つの、2ステップでは、極端な100 +の多重化を可能にする、多重インデックスと一意のバーコードの両方をキャプチャします。この記事の執筆時点では、バー- seqはバーコードのマイクロアレイ上のコスト優位性を提供しており、さらに、バー- seqは読み取り/実行数が増加するにつれて、多重化のレベルはさらにコスト削減に増加することができるように本質的に柔軟性があり。大手プラットフォームメーカーのすべてから、いくつかの"中容量"シーケンサーはさらに選択の読み出しになる可能性がシーケンシングと、バー- seqを民主化するだろう。 このプロトコルはまた、イルミナHiSeq2000に検証されています。 サッカロマイセスセレビシエの成長制御における基本的な生物学的問題に対処するためにバー- seqの使用の優秀なデモンストレーションは、グレシャムらによる最近の研究で提示されます。いくつかの重要な実験的なデザインと解釈のガイドラインを概説20。 7。プールされたスクリーニングデータの検証どんな機能ゲノミクス画面から結果が隔離栽培における個々の菌株を用いて検証する必要があります。各実験は、感受性株の数の点で異なるので、確認するために候補株の数を選択すると、ある程度任意です。ガイドとして、（通常は2〜3標準デに変換されるログ2比またはZスコアが最も感受性株のランキングと候補者のトップ25から50パーセントをテストプール内のすべての株の平均値からviationsは）コストとベネフィットのバランスです。個々の確認はどのフラスコで行わが、我々は（ 図4を参照 ）おきに測定値が15分を取って、握手分光光度計でのメディアの100μl中でOD 600が 0.06の開始接種を用いて96ウェルプレートでの成長の5世代のためにこれらのテストを行うことができます。 。 8。代表的な結果ゲノムワイドな画面は、完了、および配列は、正規化され、各菌株の動作は、データが最も容易に遺伝子を持つExcelファイルで操作される制御処理（マイクロアレイの強度を比較するか、カウント/ひずみをシーケンシングするなど）と比較したら制御/実験のlog2比によってランク付け。このように、負はlog2比が大きく、より高感度、特定の株は、試験条件になります。これらのExcelファイルは、ソフトウェアパッケージをグラフの様々なプロットすることができます。我々はそれが最も単純なY軸とX軸上の遺伝子またはORF名にはlog2比をプロットしてください。図2aに示す例では、クロトリマゾール治療（既知の抗真菌剤）のようなプロットが表示されます。 2のは、log2比による治療にかなり敏感なすべての菌株は赤で強調表示され、そして我々は通常、薬剤の同じ濃度の存​​在下でそれぞれの変異体の個々の成長のアッセイにおけるこのような菌株の多くを確認するでしょう。この例では、4株は、NCP1、ERG2とERG11の2つの独立した対立遺伝子、クロトリマゾールの既 ​​知のタンパク質のターゲットを強調表示されます。これら4遺伝子の各々は、直接エルゴステロールの生合成、コレステロールの酵母と同等に関与している。例えば、NCP1はエルゴステロールの生合成に関与しているとErg11に関連付けられていると協調的に調節されるNADP -シトクロムP450還元酵素をコードしている。この例では、既知の薬剤ターゲット（Erg11が）この公平な画面で識別されているという事実だけでなく、ターゲットの経路のいくつかの他の主要なコンポーネントを示します。最後に、赤で強調表示された遺伝子のいくつかは、エルゴステロールの生合成にまたは別個の生物学的プロセスに関与する可能性がある遺伝子を表します。前述したように、プールされた画面内の機密として検出された各菌株は、個々の増殖アッセイで敏感として確認する必要があります。図2bに示す例では、4株は、野生型親菌株、BWP17との相対的な減少の成長に基づいて、クロトリマゾールに感受性であることが確認されています。これらの個々の成長曲線は、プールされた遺伝子の薬物画面の重要な特徴を強調、それは必ずしも感度のその正確なレベルを反映していない特定の株の絶対的なランクです。さらに、図2bは、各遺伝子に複数の対立遺伝子を持っていることの価値を示す、この場合、2つのerg11破壊変異体は、わずかに感度が異なっている。感受性の程度とこれらの混乱の性質を相関させる作用の薬物のメカニズムに追加の洞察を提供することができます。 図1。プールされた増殖アッセイとバーコードの検出のためのワークフロー。文化は、プールされた細胞（ステップ1）の融解したアリコートを接種し、その後の世代の希望数の成長（ステップ2）のどちらかロボット制御（オプション）または手動（オプションB）されています。細胞を遠心分離（ステップ3）とゲノムDNAが採取される細胞を回収する（ステップ4）から分離し、uptagsとdowntagsは独立して（ステップ5）の増幅、および配列（ステップ6aまたは直接6bをステップシークエンス）にハイブリダイズされる。 図2。サンプルデータは、プロトコルの特定のポイントで採取。スクリーニングの結果（13から適応）から（A）サンプルデータ。タグ付けされた変異体のプールは、クロトリマゾールとDMSO（対照）の存在下で20世代のために増殖させた。 2比（制御の強度/治療強度）をログに記録することは計算され、遺伝子の関数としてプロットした。機密性の高い菌株（赤）クロトリマゾール、ERG11pの既知のターゲットが含まれています。このアッセイは、頻繁に化合物の実際のターゲットに加えて、他の感受性変異株をただちに検出することに注意してください。一般に、これらの変異体がターゲットと総合的に作用するものであり、一般的なストレス/治療応答の一部であるもの、または確認するために失敗した偽陽性です。確認データの（B）の例（13から適応）。プールされた増殖アッセイの結果は、個々の文化でひずみを成長させることによって検証され、野生型成長（黒）と比較することができます。 図3。マイクロアレイのハイブリダイゼーションまたはバーコードシーケンシングのためにプールされたバーコードのアッセイから生成アンプリコンの構造。各変異体のために作らリコン私n個のコレクションは、統合のためのゲノム（ATGとTAAのラベルの付いた青色の領域）、ユニークなバーコード（AGというラベルと黒のダッシュで示される）に相同性が含まれています。マイクロアレイハイブリダイゼーションのために、青色の共通プライマーは、マイクロアレイのハイブリダイゼーションのために60bpのプローブを増幅するために使用されます。バーコードシーケンシングのため、拡張されたプライマーは、イルミナアダプタ（赤いバー）、および6basesクロスハッチのインデックス）と上流のプライマーのための青色の一般的なプライマーをコードする配列から成る、PCR反応で使用され、同じコンポジットプライマー（マイナスされています第二のプライマーのための6ベースインデックス）。 図4 1個人の成長アッセイ）は、ゲノムワイドなスクリーニングと2の適切な用量を決定するために、野生型酵母に対して化合物をプレスクリーニング）ゲノムワイド画面から結果を確認。 （A）96ウェル平底プレートには0.062のODで細胞懸濁液100μlで満たされている。各ウェルには、同じ株（用量決定のための）か、別の菌株と薬剤の組み合わせを（確認のアッセイ用）を含めることができます。化合物（一般的にDMSOに溶解）の2μlを添加し、細胞を一定の30℃で16〜20時間振盪しながら成長している℃にDMSOの最終濃度が2％を超えないようにしてください。この例では、プレートの各ウェルに成長曲線を赤で制御成長曲線のプロットに対して黒でプロットされます。互いの上に重ね合わせ例の薬を用いて得られたいくつかのprescreensの（B）より高い解像度のイメージ。この滴定のシリーズでは、IC 10-15紫の用量で取得され、削除のプロファイリング（HIPとHOP）に適しているでしょう。高い光学密度での非直線性に起因する、テカン（または任意の同様のプレートリーダー）ODSは、"従来の"1ミリメートル経路長のキュベットで得られたものを使用して校正する必要があります。

Discussion

ここでは、簡単にタグ付けされた変異体のコレクションを作成するためにさまざまな微生物のバーコード変異体コレクションの既存のコレクションの広い範囲に適合させることができる、ささやかな変更で、プロトコルを概説。我々は病原性酵母C.のタグトランスポゾン突然変異誘発のプロトコルを報告している間、我々はそれを強調するアルビカンス 、非常によく似たプロトコルは、単細胞の菌類の多様なに適応することができます。変更された、このプロトコルは、細菌¹³には適切に動作し、現在追加の真菌や細菌ゲノムの数のコレクションが建設中です。現時点では、このアッセイは、遺伝子-小分子の相互作用のための唯一の包括的な、ゲノムワイドな画面を提供します。アッセイの一つ、特に魅力的な機能は、遺伝子や低分子化合物の事前知識を必要としないことです。これらのアッセイの範囲とパワーにもかかわらず、他のラボへの譲渡は、結果の分析のための初期設備投資と情報ツールによって幾分妨げられてきた。分析のための堅牢なツールと組み合わせて次世代シーケンスの読み出しの採用により、我々は彼らの採用が増加すると予想。

Materials

Antibiotics	Vendor and catalogue numbers
Carbenicillin	Sigma, part# C1613
Kanamycin	Sigma, part# K1876
spectinomycin	Sigma, part# S0692
Chloramphenicol	Sigma, part# C0378
DNA Clean-up and concentration kits
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen, part# 27106
HiSpeed Plasmid Maxi Kit	Qiagen, part# 12663
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen, part# 28106
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen, part# 28704
PCR and electrophoresis reagents
Taq DNA Polymerase (Mg-free) Buffer	New England Biolabs, part# M0320L
Deoxynucleotide Solution Mix	New England Biolabs, part# N0447L
25 mM MgCl2	Sigma, part# 63036
Agarose, loading dye, and nucleic acid stain suitable for gel electrophoresis	Various
10X TAE buffer	Sigma, part# T8280
1 Kb Plus DNA Ladder	Invitrogen, part# 10787026
YPD broth
10 g of yeast extract	Sigma, part# Y1625
20 g Bacto peptone	BD Biosciences, part# 211677
20 g of dextrose	Sigma, part# D9434
Labware
Multichannel pipettes (1000, 200, and 20 μL)	Various
Disposable pipetting reservoirs	Various
15 and 50 mL centrifuge tubes	Various
96- and 384-Well Deep Well Plates	Axygen Scientific, part# P-2ML-SQ-C-S & P-384240SQCS
96-well and 384-well PCR plates and seal film	Various
Plate roller for sealing multi-well plates	Sigma, part# R1275
30°C and 37°C shaking incubators for growing bacterial and yeast on plates and in tubes	Various
In vitro transposon mutagenesis
EZ-Tn5 Transposase	Epicentre Biotechnologies, part# TNP92110
High-throughput transformation
Seqprep 96 HT Plasmid Prep Kit	Edge Biosystems, part# 84359
polyethylene glycol, molecular weight 3350	Various
lithium acetate	Sigma, part# 517992
6-well plates, sterile	Corning, part# 3335
50 mg/mL uridine	Sigma, part# U3750
100X Tris-EDTA buffer solution	Sigma, part# T9285
1X TE/0.1M LiOAc	Various
salmon testis DNA	Sigma, part# 1626
Growth of barcoded collections
48-well plates; if growing cultures in plates	Greiner, part# M9437
Adhesive plate seals	ABgene, part# AB-0580
200 mL culture flasks	Various
Spectrophotometer capable of absorbance	Various
Temperature-controlled shaker for 250 ml flasks or shaking spectrophotometer	Various
Safe-Lock Microcentrifuge Tube, 2 mL	Eppendorf, part# 0030 120.094
Hybridization equipment
Hybridization Oven 640	Affymetrix, part# 800138
GeneChip Fluidic Station 450	Affymetrix, part# 00-0079
GeneArray Scanner 3000	Affymetrix, part# 00-0212
Boiling water bath with floating rack	Various
Hybridization consumables
Genflex Tag 16K Array v2	Affymetrix, part# 511331
Denhardt’s Solution, 50X concentrate	Sigma, part# D2532
Streptavidin, R-phycoerythrin conjugate (SAPE)	Invitrogen, part# S866
Safe-Lock Microcentrifuge Tube, 0.5 mL	Eppendorf, part# 0030 123.301
Teeny Tough-Spots	Diversified Biotech, part# LTTM-1000
0.5 M EDTA	BioRad, part# 161-0729
10% Tween	Sigma, part# T2700
MES free acid monohydrate	Sigma, part# M5287
MES sodium salt	Sigma, part# M5057
5 M NaCl	Sigma, part# 71386
20X SSPE	Sigma, part# S2015
Molecular biology grade water	Sigma, part# W4502
Hybridization Primers	Various suppliers (standard desalting)
Uptag	5′ GATGTCCACGAGGTCTCT 3′
Buptagkanmx4	5′ biotin-GTCGACCTGCAGCGTACG 3′
Dntag	5′ CGGTGTCGGTCTCGTAG 3′
Bdntagkanmx4	5′ biotin-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3′
B213	5′ biotin-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3′
Uptagkanmx	5′ GTCGACCTGCAGCGTACG 3′
Dntagkanmx	5’GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3′
Uptagcomp	5’AGAGACCTCGTGGACATC 3′
Dntagcomp	5’CTACGAGACCGACACCG 3′
Upkancomp	5’CGTACGCTGCAGGTCGAC 3′
Dnkancomp	5’CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3′
Sequencing Primers: Illumina Platform	Various suppliers
UpTag Forward (100uM)	5′ CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3′
UpTag Reverse (100uM)	5′ AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3′
DownTag Forward (100uM)	5′ CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3′
DownTag Reverse (100uM)	5′ AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3`
Read 1 UP-tag seq primer (100uM)	5′ GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3′
Read 1 DOWN-tag seq primer (100uM)	5′ CGG TGT CGG TCT CGT AG 3′
Read 2 Index Sequencing primer (standard Illumina R1 primer) (100uM)	5′ AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3′
Additional Sequencing Reagents/Equipment
Qiagen MinElute 96 UF PCR purification Kit	Qiagen, part# 29051
Vaccum pump	Any vendor
Macherey-Nagel Vaccum Manifold	Macherey-Nagel, part# 740 681
Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen, part# Q32853
Invitrogen Qubit assay tubes	Invitrogen, part# Q32856
40% acrylamide plus 1% N,N’-methylene-bis-acrylamide, 37.5:1	Bio Rad, part# 161-0148
Tris Base	Sigma, part# T1503-1KG
Boric Acid	Sigma, part# B6768-500G
0.5M EDTA, pH 8.0	Teknova, part# E0306
Ammonium Persulfate	Sigma, part# A3678-25G
TEMED	Bioshop, part# TEM001.25
Ethidium Bromide Solution	Bioshop, part# ETB444.10
0.5M Ammonium acetate	Teknova, part# A2000
10mM Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma, part# M0631-100G
1mM EDTA, pH 8.0	See 0.5M EDTA, pH 8.0
Ethanol	Various
Sodium acetate, pH 5.2	Teknova, part# S0297
Speed vacuum	Various
Single-Read Cluster Generation Kit	Illumina, part# GD-300-1001
36c Sequencing Kit v4	Illumina, part# FC-104-4002

10X TBE recipe

Amounts	Reagents
108 grams	Tris Base
55 grams	Boric Acid
40mL	0.5M EDTA (pH 8.0)
Add dH2O to 1L mark

12% Polyacrylamide gel recipe

Volumes	Reagents
5.8 ml	40% acrylamide plus 1% N,N’-methylene-bis-acrylamide, 37.5:1
12 ml	dH2O
2 ml	10X TBE
140 μl	10% Ammonium Persulfate
Total volume: 20ml

Uptag primer mix:

Resuspend Uptag and Buptagkanmx4 each in ddH₂O at 100 μM, then mix in a 1:1 ratio for a final concentration of 50 μM each. Store at -20°C.

Downtag primer mix:

Resuspend Dntag and Bdntagkanmx4 each in ddH₂O at 100 μM, then mix in a 1:1 ratio for a final concentration of 50 μM each. Store at -20°C.

Mixed oligonucleotides:

Resuspend each of the following eight oligos (standard desalted) in ddH₂O at 100 μM:
Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp.
Mix an equal volume of the eight oligonucleotides for a final concentration of 12.5 μM each.

12X MES stock:

For 10 ml, dissolve 0.7 g MES free acid monohydrate and 1.93 g MES sodium salt in 8 ml molecular biology grade water. After mixing well, check pH and adjust if needed to a pH 6.5-6.7. Add water to a total volume of 10 ml. Filter sterilize and store at 4°C protected from light (e.g., wrap the tube in foil). Replace if solution becomes visibly yellow or after 6 months.

2X Hybridization buffer:

For 50 ml, mix 8.3 ml of 12X MES stock (from 2.9.14), 17.7 ml of 5 M NaCl, 4.0 ml of 0.5 M EDTA, 0.1 ml of 10% Tween 20 (vol/vol), and 19.9 ml filtered ddH₂O. Filter sterilize.

Wash A: Mix 300 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol/vol), 699 ml ddH₂O. Filter sterilize.
Wash B: Mix 150 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol/vol), 849 ml ddH₂O. Filter sterilize.

Barcode sequencing primers

In UP-tag primer sequences the 5′ tail (bold) are Illumina specific adaptor sequences incorporated into the F and R primer. The variable sequence (italics) represents the 5-mer indexing tag used in multiplexing/ index read-out. The 3′ tail (underlined) represents the common primer flanking the uptag barcode and is required to amplify the yeast barcodes.

In DOWN-tag primer sequences the 5′ tail is identical to 5′ tail of UP-tag primers (Illumina specific sequence), however, the 3′ tail (underlined) is replaced with the common primers that are used to amplify the DOWN-tag barcodes.