Мутации в kisspeptin рецепторов (KISS1R) связаны с репродуктивные расстройства у больных. Здесь мы опишем, как ввести мутации интереса к GC-богатые последовательности KISS1R, а также использование конструкций KISS1R охарактеризовать путь деградации рецептора иммунопреципитации и иммуноблоттинга
Kisspeptin рецепторов (KISS1R) является G-белком рецептор признан курок полового созревания и регулятором репродуктивной компетенции в зрелом возрасте 1,2,3. Инактивирующих мутаций в KISS1R идентифицированы у пациентов были связаны с iodiopathic гипогонадотропный гипогонадизм (IHH) 1,2 и преждевременным половым созреванием 4. Функциональные исследования этих мутантов имеют решающее значение для понимания механизмов, лежащих в регуляции размножения этим рецептором, а также теми, кто определяет болезнь результаты, которые получаются в результате ненормального сигнализации KISS1R и функции. Тем не менее, высоко GC-богатые последовательности гена KISS1R делает его довольно трудно представить мутации или усиливать ген, кодирующий этот рецептор с помощью ПЦР.
Здесь мы опишем метод введения мутаций интерес в этой весьма GC-богатые последовательности, которые были успешно использованы для создания более десятка KISS1R мутантов в нашей лаборатории. Мы оптимизировали ПЦР условия для облегчения усиления спектр KISS1R мутантов, которые включают замены, делеции или вставки в последовательности KISS1R. Помимо решения ПЦР усилитель, а также небольшой процент ДМСО были особенно полезны для улучшения усиления. Такая оптимизированная процедура может быть полезным для других GC-богатых шаблонов, а также.
Выражение вектора, кодирующего KISS1R это использовалось для характеристики сигнализации и функции этого рецептора для того, чтобы понять, как мутации могут менять KISS1R функции и привести к репродуктивным связанных фенотипов. Соответственно, возможности применения KISS1R мутантов порожденных сайт-направленного мутагенеза можно проиллюстрировать многими исследованиями 1,4,5,6,7,8. Как, например, получить-функции мутации в KISS1R (Arg386Pro), что связано с преждевременным половым созреванием, как было показано, чтобы продлить реагирования рецептора лиганда стимуляции 4, а также изменять скорость деградации KISS1R 9 . Интересно, что наши исследования показывают, что KISS1R разлагается под протеасомы, в отличие от классического лизосомальных деградации описаны для большинства G-белком рецепторы 9. В примере, приведенном здесь, деградация KISS1R исследуется в человеческих эмбриональных клеток почки (HEK-293) временно выражения Myc с метками KISS1R (MycKISS1R) и обрабатывают протеасом или лизосомы ингибиторов. Сотовые лизатов являются иммунопреципитации использованием агарозы-сопряженных анти-Myc антител с последующим анализом пятно западной. Обнаружение и количественное определение MycKISS1R на пятна осуществляется с помощью LI-COR Odyssey Инфракрасная система. Такой подход может быть полезным при изучении деградации других белков интерес.
Сайт-направленный мутагенез был использован для исследования функции белка, вводя изменения в нуклеотидной последовательности, кодирующей целевых генов на протяжении более трех десятилетий. Оригинальная методика была описана в 1978 году англо-канадского химик, лауреат Нобелевской пр?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа частично финансировалась Репродуктивное отделения Национального института детского здоровья и человеческого развития (NICHD – R21 HD059015) и Чарльз Х. Худа Фонд молодых следователь ребенка исследованиям в области здравоохранения премию (Бостон, Массачусетс).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 |
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene | 600385 |
Dpn-I | New England Biolabs | R0176 |
XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene | 200314 |
DMEM | Cellgro | 10-013-CV |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 |
Leupeptin | Calbiochem | 108975 |
MG132 | Calbiochem | 47491 |
10xPBS | Ambion | AM9625 |
Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24948 |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | Millipore | 16-219 |
2x loading buffer | BioRad | 161-0737 |
Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | BioRad | 345-0028 |
Immobilon-FL PVDF membrane | Millipore | IPFL00010 |
Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
10xTBS | BioRad | 170-6435 |
Rabbit anti-myc antibody | Cell signaling | 2272 |
Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 78430 |