Het meten van de kinetiek van mRNA transcriptie in Single levende cellen
Summary
RNA polymerase II transcriptionele kinetiek worden gemeten op specifieke genen in levende cellen. mRNA getranscribeerd van het gen van belang zijn fluorescent gelabeld en het gebruik van Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) de in vivo kinetiek van transcriptionele rek worden verkregen.
Abstract
De transcriptionele activiteit van RNA polymerase II (Pol II) is een dynamisch proces en dus het meten van de kinetiek van de transcriptie proces in vivo is van belang. Pol II kinetiek is gemeten met behulp van biochemische of moleculaire methoden. 1-3 In de afgelopen jaren, met de ontwikkeling van nieuwe visualisatie methoden, is het mogelijk geworden om transcriptie te volgen als het zich voordoet in real-time in enkele levende cellen. 4 Hierin beschrijven we hoe uit te voeren analyse van de Pol II rek kinetiek op een specifiek gen in levende cellen. 5, 6 Het gebruik van een cellijn, waarin een specifiek gen locus (DNA), de mRNA product, en het uiteindelijke eiwit fluorescent product kan worden geëtiketteerd en gevisualiseerd in vivo , is het mogelijk om de werkelijke transcriptie van mRNA te detecteren op het gen van belang. 7, 8 Het mRNA wordt fluorescent gelabeld met het MS2 systeem voor tagging mRNA in vivo, waar de 3'UTR van het mRNA transcripts bevatten 24 MS2 stam-lus herhaalt, die zeer specifieke bindingsplaatsen voor de YFP-MS2 laag eiwit dat het mRNA labels zoals het is overgeschreven te bieden. 9 Om de kinetiek van transcriptie we het Fluorescence Recovery gebruik Na Photobleaching (FRAP) methode te controleren. Door fotobleken de YFP-MS2-gelabeld ontluikende transcripten op de site van transcriptie en vervolgens na het herstel van dit signaal in de tijd, we de synthese snelheid van de nieuw gemaakte mRNA's te verkrijgen. 5 Met andere woorden, YFP-MS2 fluorescentie herstel weerspiegelt de generatie van de nieuwe MS2 stam-lussen in de opkomende transcripties en hun binding door TL-free YFP-MS2 moleculen die van de omringende nucleoplasm. De FRAP herstel curves zijn vervolgens geanalyseerd met behulp van wiskundige mechanistische modellen geformaliseerd door een reeks van differentiaalvergelijkingen, om de kinetische parameters tijd van de transcriptie te halen.
Protocol
Discussion
De methode voor het meten van polymerase kinetische activiteit in levende cellen kunnen worden onderverdeeld in twee delen. Het eerste deel beschrijft de 'natte' procedure die het meten en het ophalen van de kinetische gegevens van mRNA transcriptie mogelijk maakt, terwijl in het tweede deel, de gegevens worden geanalyseerd met behulp van een ODE-model. 5 Een aantal studies hebben inmiddels deze aanpak voor de extractie gebruikt transcriptie kinetiek in levende cellen 5, 6, 8, 12-14. Het gr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS-T wordt ondersteund door de European Research Council (ERC), de Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israël Cancer Research Fund (ICRF), Duits-Israëlische Stichting voor Wetenschappelijk Onderzoek en Ontwikkeling (GIF ), de VS-Israel Binationale Science Foundation (BSF), Duits-Israëlische Project Samenwerking (DIP), en de Israëlische ministeries van Wetenschap en Gezondheid, en is het Jane Stern Lebell Familie Fellow in Life Sciences aan de Bar-Ilan Universiteit. YB is dankbaar voor de Azrieli Stichting voor de toekenning van een Azrieli gemeenschap.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
References
- Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
- Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
- Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
- Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
- Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
- Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
- Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
- Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
- Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
- Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
- Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
- Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
- Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
- Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
- Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
