Mesure de la cinétique de la transcription d'ARNm dans les cellules vivantes simples
Summary
L'ARN polymérase II cinétiques transcriptionnelles sont mesurés sur des gènes spécifiques dans les cellules vivantes. ARNm transcrit à partir du gène d'intérêt sont marqués par fluorescence et de l'utilisation de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) la cinétique in vivo de l'élongation de la transcription sont obtenues.
Abstract
L'activité transcriptionnelle de l'ARN polymérase II (Pol II) est un processus dynamique et donc de mesurer la cinétique du processus de transcription in vivo est d'importance. Pol II cinétiques ont été mesurées en utilisant des méthodes biochimiques ou moléculaires. 1-3 dernières années, avec le développement de nouvelles méthodes de visualisation, il est devenu possible de suivre la transcription comme il se produit en temps réel dans les cellules vivantes unique. 4 des présentes, nous décrivons comment pour effectuer l'analyse de la cinétique de la Pol II allongement sur un gène spécifique dans les cellules vivantes. 5, 6 utilisant une lignée cellulaire dans laquelle un locus spécifique (ADN), son produit ARNm et la protéine finale peut être marqué par fluorescence et visualisés in vivo , il est possible de détecter la transcription réelle des ARNm du gène d'intérêt. 7, 8 L'ARNm est fluorescence marqués en utilisant le système d'ARNm MS2 marquage in vivo, où le 3'UTR de l'ARNm transcrits contenant 24 MS2 tige-boucle répète, qui fournissent très spécifiques des sites de liaison pour la protéine d'enveloppe YFP-MS2 que les étiquettes de l'ARNm comme il est transcrit. 9 Pour contrôler la cinétique de la transcription, nous utilisons la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) méthode. Par photoblanchiment les transcriptions YFP-MS2-taggés naissante sur le site de la transcription et ensuite après la reprise de ce signal dans le temps, on obtient le taux de synthèse de l'ARNm nouvellement fabriqués. 5 En d'autres termes, YFP-MS2 récupération de fluorescence reflète la nouvelle génération de nouveaux MS2 tiges-boucles dans les transcriptions naissantes et leur liaison par des fluorescents YFP-MS2 gratuitement molécules entrant dans le nucléoplasme environnantes. Les courbes de récupération du PAF sont ensuite analysés en utilisant des modèles mécanistes mathématiques formalisées par une série d'équations différentielles, afin de récupérer les paramètres de temps cinétique de la transcription.
Protocol
Discussion
La méthode pour mesurer l'activité polymérase cinétique dans les cellules vivantes peuvent être divisés en deux parties. La première partie décrit le «mouillé» la procédure qui permet la mesure et la récupération des données cinétiques de transcription ARNm, alors que dans la seconde partie, les données sont analysées en utilisant un modèle ODE. 5 Un certain nombre d'études ont maintenant utilisé cette approche pour l'extraction cinétique de la transcription dans les cellules…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS-T est soutenu par le Conseil européen de la recherche (CER), l'Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israël Cancer Research Fund (ICRF), l'Allemagne et Israël Fondation pour la recherche scientifique et le développement (GIF ), Etats-Unis-Israël binational Science Foundation (BSF), Projet de coopération israélo-allemande (DIP), et les Ministères israéliens de la Science et de la santé, et est Fellow de la famille Stern Jane Lebell en sciences de la vie humaine en université Bar-Ilan. YB est reconnaissante à la Fondation Azrieli pour l'octroi d'une bourse Azrieli.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
References
- Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
- Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
- Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
- Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
- Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
- Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
- Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
- Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
- Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
- Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
- Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
- Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
- Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
- Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
- Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
