מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד
Summary
RNA פולימראז II קינטיקה תעתיק נמדדים על גנים ספציפיים בתאים חיים. mRNAs עיבד מן הגן של עניין מתויגים fluorescently באמצעות שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) ב קינטיקה vivo של התארכות תעתיק מתקבלים.
Abstract
פעילות תעתיק של RNA פולימראז II (Pol II) הוא תהליך דינמי ולכן למדידת קינטיקה של התהליך תעתיק in vivo הוא בעל חשיבות. פול קינטיקה השנייה נמדדו בשיטות ביוכימיות או מולקולריות. 1-3 בשנים האחרונות, עם התפתחות שיטות ההדמיה החדשה, זה הפך להיות אפשרי לעקוב שעתוק כפי שהוא מתרחש בזמן אמת בתאים חיים אחת. 4 בזאת אנו מתארים כיצד לבצע ניתוח של Pol II התארכות קינטיקה על גן ספציפי בתאים חיים. 5, 6 בעזרת קו התא שבו מוקד גן מסוים (DNA), מוצר ה-mRNA שלו, המוצר הסופי חלבון יכול להיות שכותרתו fluorescently ו דמיינו in vivo ניתן לזהות את שעתוק בפועל של mRNAs על הגן של עניין. 7, 8 mRNA מתויג fluorescently באמצעות מערכת MS2 עבור mRNAs תיוג in vivo, שבו 3'UTR של תעתיקי mRNA להכיל 24 MS2 גזע לולאה חוזר, אשר מספקים אתרי קישור ספציפיים מאוד של חלבון YFP-MS2 את המעיל כי התוויות mRNA כפי שהוא עיבד. 9 כדי לפקח על קינטיקה של שעתוק אנו משתמשים השחזור Fluorescence לאחר photobleaching (FRAP) שיטה. על ידי photobleaching YFP-MS2-tagged תמלילי המתהווה באתר של שעתוק ולאחר מכן בעקבות ההתאוששות של האות הזה לאורך זמן, אנו מקבלים את קצב הסינתזה של mRNAs שנעשו לאחרונה. 5 במילים אחרות, YFP-MS2 התאוששות הקרינה משקף את דור החדש של MS2 גזע לולאות בפרוטוקולים המתהווה ומחייבת שלהם על ידי YFP-MS2 פלורסנט חופשי מולקולות להיכנס מ nucleoplasm שמסביב. עקומות ההתאוששות FRAP מנותחים ואז באמצעות מודלים מתמטיים מכניסטית פורמלית על ידי סדרה של משוואות דיפרנציאליות, על מנת לשלוף את הפרמטרים זמן הקינטית של שעתוק.
Protocol
Discussion
השיטה למדידת פעילות פולימראז קינטית בתאים חיים יכול להיות מחולק לשני חלקים. החלק הראשון מתאר את נוהל "רטוב" המאפשר מדידה ואחזור של הנתונים הקינטית של שעתוק ה-mRNA, ואילו בחלק השני, הנתונים נותחו באמצעות מודל אודה. 5 מספר מחקרים מנוצל כיום גישה זו לחילוץ קינטי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
י"ש-T נתמכת על ידי המועצה האירופית למחקר (ERC), הקרן הלאומית למדע (ISF) (250/06), ISF, ביכורה, ישראל הקרן לחקר הסרטן (ICRF), גרמנית ישראלי קרן למחקר ופיתוח מדעי (GIF ), ארה"ב וישראל דו לאומית למדע (BSF), גרמניה, פרויקט שיתוף פעולה ישראלי (מח"ש), משרדי הישראלית למדע הבריאות, היא ג'יין שטרן עמית Lebell משפחה במדעי החיים באוניברסיטת בר אילן. י.ב. מודה לקרן עזריאלי לפרס של עמיתי עזריאלי.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
References
- Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
- Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
- Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
- Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
- Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
- Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
- Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
- Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
- Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
- Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
- Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
- Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
- Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
- Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
- Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
