एकल जीवित कोशिकाओं में mRNA ट्रांसक्रिप्शन के कैनेटीक्स माप
Summary
शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय transcriptional कैनेटीक्स जीवित कोशिकाओं में विशेष जीन पर मापा जाता है. ब्याज की जीन से लिखित mRNAs fluorescently टैग और प्रतिदीप्ति वसूली के बाद photobleaching (FRAP) transcriptional बढ़ाव के vivo कैनेटीक्स में प्राप्त कर रहे हैं का उपयोग कर रहे हैं.
Abstract
शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय (पोल द्वितीय) के transcriptional गतिविधि एक गतिशील प्रक्रिया है और इसलिए vivo में transcriptional प्रक्रिया के कैनेटीक्स को मापने के महत्व का है. पोल द्वितीय कैनेटीक्स जैव रासायनिक या आणविक विधियों का उपयोग कर मापा गया है हाल के वर्षों में. 1-3 नए दृश्य तरीकों के विकास के साथ, यह संभव बन गया है प्रतिलेखन पालन के रूप में यह एक जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय में होता है इस के साथ साथ 4. हम कैसे वर्णन 5 जीवित कोशिकाओं में एक विशेष जीन पर पोल द्वितीय बढ़ाव कैनेटीक्स का विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए, एक सेल लाइन में एक विशेष जीन (डीएनए) बिन्दुपथ, इसके mRNA उत्पाद, और अंतिम प्रोटीन उत्पाद fluorescently हो और लेबल कर सकते हैं, vivo में कल्पना का प्रयोग 6 , यह संभव है ब्याज की जीन पर mRNAs का वास्तविक प्रतिलेखन का पता लगाने के 7, 8 mRNA fluorescently vivo में, जहां mRNA टेप की 3'UTR 24 MS2 स्टेम पाश होते टैगिंग mRNAs लिए MS2 प्रणाली का उपयोग में है टैग. दोहराता है, जो YFP-MS2 कोट प्रोटीन है कि mRNA लेबल के रूप में यह लिखित है के लिए अत्यधिक विशिष्ट बाध्यकारी साइटों प्रदान करते हैं. 9 प्रतिलेखन के कैनेटीक्स हम विधि (FRAP) photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली का उपयोग की निगरानी करने के लिए. प्रतिलेखन की साइट पर टैग YFP-MS2-नवजात टेप photobleaching और फिर समय पर इस संकेत की वसूली के बाद से, हम दूसरे शब्दों में नव बनाया mRNAs का संश्लेषण की दर प्राप्त करने के 5, YFP MS2 प्रतिदीप्ति वसूली पीढ़ी को दर्शाता है नई MS2 फ्लोरोसेंट मुक्त YFP MS2 अणुओं आसपास के nucleoplasm से प्रवेश करने से नवजात और उनके बंधन टेप में स्टेम छोरों. FRAP वसूली घटता है तो गणितीय यंत्रवत अंतर समीकरणों की एक श्रृंखला के द्वारा औपचारिक रूप मॉडल का उपयोग करते हुए, क्रम में करने के लिए प्रतिलेखन की गतिज समय पैरामीटर प्राप्त करने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं.
Protocol
Discussion
जीवित कोशिकाओं में पोलीमर्स गतिज गतिविधि को मापने के लिए विधि को दो भागों में विभाजित किया जा सकता है. पहला भाग 'गीले' प्रक्रिया है जो मापने और mRNA प्रतिलेखन की गतिज डेटा पुन: प्राप्त करने में सक्षम बना…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वाईएस टी यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी), इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (ISF) (250/06), ISF-Bikura, इसराइल कैंसर रिसर्च फंड (ICRF), वैज्ञानिक अनुसंधान और विकास के लिए जर्मन – इजरायल फाउंडेशन (GIF द्वारा समर्थित है ), संयुक्त राज्य अमेरिका इसराइल Binational विज्ञान फाउंडेशन (बीएसएफ), जर्मन इजरायल परियोजना (डुबकी), सहयोग, और विज्ञान और स्वास्थ्य के इजरायल के मंत्रालयों, और जेन बार इलान विश्वविद्यालय में स्टर्न Lebell लाइफ साइंसेज में परिवार फैलो है. YB Azrieli फाउंडेशन के लिए एक Azrieli फैलोशिप के पुरस्कार के लिए आभारी है.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
References
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