Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo
Summary
RNA polimerasi II cinetica trascrizionali sono misurate su specifici geni nelle cellule viventi. mRNA trascritto dal gene di interesse sono fluorescente tag e l'utilizzo di recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) la cinetica in vivo di allungamento della trascrizione si ottengono.
Abstract
L'attività trascrizionale della RNA polimerasi II (Pol II) è un processo dinamico e quindi misurare la cinetica del processo di trascrizione in vivo è di importanza. Pol cinetica II sono stati misurati utilizzando metodi biochimici o molecolari. 1-3 Negli ultimi anni, con lo sviluppo di nuovi metodi di visualizzazione, è diventato possibile seguire la trascrizione di quanto avviene in tempo reale in cellule viventi solo 4. Qui si descrivono le modalità di eseguire analisi di Pol II cinetica allungamento su uno specifico gene in cellule viventi. 5, 6 Utilizzando una linea cellulare in cui un locus specifico gene (DNA), il suo prodotto l'mRNA, e il prodotto finale può essere proteina fluorescente e visualizzati in vivo , è possibile rilevare la trascrizione reale di mRNA del gene di interesse. 7, 8 L'mRNA è fluorescente tag MS2 utilizzando il sistema di tagging per mRNA in vivo, dove il 3'UTR dei trascritti di mRNA contiene 24 MS2 stem-loop ripete, che forniscono i siti di legame altamente specifico per il YFP-MS2 proteina di rivestimento che le etichette l'mRNA come è trascritto. 9 Per monitorare la cinetica di trascrizione usiamo il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) metodo. Dal fotodecolorazione il YFP-MS2-tagged trascrizioni nascente nel sito di trascrizione e poi dopo il recupero di questo segnale nel tempo, si ottiene il tasso di sintesi del mRNA di nuova fabbricazione. 5 In altre parole, YFP-MS2 recupero fluorescenza riflette la generazione di nuovo MS2 staminali loop nelle trascrizioni nascente e il loro legame con fluorescente libero YFP-MS2 molecole che entrano dalla nucleoplasma circostante. Le curve di recupero FRAP vengono poi analizzati utilizzando modelli meccanicistici matematici formalizzati da una serie di equazioni differenziali, al fine di recuperare i parametri cinetici tempo di trascrizione.
Protocol
Discussion
Il metodo per la misurazione dell'attività cinetica polimerasi nelle cellule viventi possono essere suddivisi in due parti. La prima parte descrive la procedura di 'umido', che consente la misurazione e il recupero dei dati cinetici di trascrizione mRNA, mentre nella seconda parte, i dati vengono analizzati utilizzando un modello ODE. 5 Una serie di studi hanno utilizzato questo metodo per l'estrazione cinetica di trascrizione nelle cellule viventi 5, 6, 8, 12-14. La principale dif…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS-T è sostenuta dal Consiglio europeo della ricerca (CER), la Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israele Cancer Research Fund (ICRF), tedesco-israeliano Fondazione per la ricerca scientifica e lo sviluppo (GIF ), Stati Uniti-Israele binazionale Science Foundation (BSF), tedesco-israeliano di cooperazione Project (DIP), ei ministeri israeliani della scienza e della Salute, ed è il Jane Stern Fellow Famiglia LeBell in Scienze della vita alla Bar-Ilan University. YB è grato alla Fondazione Azrieli per l'assegnazione di una borsa Azrieli.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
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