単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定
Summary
RNAポリメラーゼII転写反応速度は、生きた細胞内の特定の遺伝子を測定しています。興味のある遺伝子から転写されるmRNAは、蛍光標識と（FRAP）転写伸長の生体内動態が得られる光退色後蛍光回復を使用しています。
Abstract
RNAポリメラーゼII（pol II）の転写活性は、ダイナミックなプロセスであるため、in vivoでの転写過程の動態を測定することは重要である。 pol IIの動力学は、生化学的または分子の方法を用いて測定されている。近年、1-3、新しい可視化手法の開発と、それは一つの生きた細胞でリアルタイムに発生するように転写をフォローすることが可能となっている4ここでは、我々はどのように記述する特定の遺伝子座（DNA）、そのmRNAの製品、および最終のタンパク質産物を蛍光標識し、 生体内で可視化することのできる細胞株を用いた生細胞内の特定の遺伝子ではPol II伸長速度の解析を実行する。5、6 、それは目的の遺伝子のmRNAの実際の転写を検出することが可能である。7、8 mRNAを蛍光mRNA転写産物の3'UTRが24 MS2ステムループを含む生体内でのタギングのmRNAは、のためMS2システムを使ってタグ付けされているそれが転写されるmRNAを標識するYFP – MS2のコートタンパク質に高い特異的結合部位を提供繰り返し、9我々は（FRAP）法を光退色後蛍光回復を使用して転写の動態を監視するには。転写のサイトでYFP – MS2 -タグ付きの新生転写物を退色して、時間をかけてこの信号の回復が続くことによって、我々は新たに作られたmRNAの合成速度を得る5。言い換えると、YFP – MS2蛍光の回復は、世代を反映新しいMS2の蛍光フリーYFP – MS2周辺核質から入る分子による新生の転写産物とそれらの結合の幹ループ。 FRAPの回復曲線は、転写の運動の時間パラメータを取得するために、微分方程式のシリーズが正式な数学的機械論的モデルを用いて分析している。
Protocol
Discussion
生きた細胞でポリメラーゼ運動活性の測定方法は2つの部分に分けることができます。最初の部分は第二部では、データはODEのモデルを用いて分析されるのに対し、測定し、mRNAの転写の動力学的データの取得を可能にする"ウェット"の手順を説明します。5件の研究の数は今や抽出するためのこのアプローチを利用している生きた細胞を5、6、8、12-14の転写動態。これら?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS – Tは、欧州研究評議会（ERC）、イスラエル科学財団（ISF）（250/06）、ISF – Bikura、イスラエル癌研究基金（ICRF）、科学研究と開発のためのドイツとイスラエル基金（GIFでサポートされています）、米国 – イスラエル二国間科学財団（BSF）、ドイツとイスラエルのプロジェクトの協力（DIP）、そして科学と健康のイスラエルの省庁、およびバー- Ilan大学でライフサイエンスのジェーンスターンLebellファミリーフェローです。 YBはAzrieliのフェローシップの受賞のためのAzrieli財団に感謝です。
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
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