싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정
Summary
RNA 효소 II transcriptional 운동은 살아있는 세포에서 특정 유전자를 측정합니다. 관심의 유전자에서 베꼈는데 mRNAs는 찬란 태그와 (FRAP) transcriptional 신장의 생체내 반응 속도론에있는가를 얻을 수있다 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하고 있습니다.
Abstract
RNA 중합 효소 II (폴 II)의 transcriptional 활동은 역동적인 과정이므로 생체내의 transcriptional 프로세스의 속도론을 측정하는 것은 중요하다. 폴 II의 속도론이 생화 학적 또는 분자 방법을 사용하여 측정하고 있습니다. 1-3 최근에는 새로운 시각화 방법의 개발, 그것은 하나의 살아있는 세포에서 실시간으로 발생하는 등 전사에 따라 가능한되었다 4. 여기에 우리는 방법에 대해 설명합니다 특정 유전자 로커스 (DNA), 그 mRNA의 제품 및 최종 단백질 제품이 찬란 표시 및 생체내에서 시각 수있는 세포주를 사용하여 살아있는 세포의 특정 유전자에 대한 폴 II 신장 속도론의 분석을 수행할 수 있습니다. 5, 6 , 그것은 관심의 유전자에 mRNAs의 실제 전사를 감지할 수 있습니다. 7, 8 mRNA가 찬란 mRNA의 기록의 3'UTR 24 MS2 줄기 루프를 포함하는 생체내에 태그 mRNAs위한 MS2 시스템을 이용하여 태그입니다 그것이 베꼈는데 그대로 mRNA를 레이블 YFP – MS2 코트 단백질에 대한 매우 구체적인 구속력이 사이트를 제공하는 반복은 9. 우리가 (FRAP) 메서드를 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하여 녹음의 속도론을 모니터링합니다. 녹음의 사이트에있는 YFP – MS2 – 태그 초기 기록을 photobleaching 후 시간이 지남에 따라이 신호의 복구를 수행함으로써, 우리가 새로 만든 mRNAs의 합성 속도를 얻는 5. 즉, YFP – MS2 형광 복구 생성을 반영 새로운 MS2의 형광 무료 YFP – MS2는 주변 nucleoplasm에서 입력 분자에 의해 초기 기록과 바인딩에 줄기 루프. FRAP 복구 곡선은 다음 녹음의 운동 시간 매개 변수를 검색하기 위해, 미분 방정식의 시리즈 공식 수학 기계론의 모델을 사용하여 분석하고 있습니다.
Protocol
Discussion
살아있는 세포에서 효소 운동 활동을 측정하는 방법은 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 부분은 두 번째 부분에서 데이터가 ODE 모델을 사용하여 분석 반면, 측정 및 mRNA의 전사의 운동 데이터를 가져올 수있는 '서부 유럽 표준시'절차를 설명합니다. 5 연구의 숫자가 지금은 추출이 접근 방법을 활용해야 살아있는 세포 5, 6, 8, 12-14에서 전사 속도론. 이러한 연구 사이의 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS – T은 과학적 연구와 개발을위한 독일 – 이스라엘 재단 유럽 연구위원회 (ERC), 이스라엘 과학 재단 (ISF) (250/06), ISF – Bikura, 이스라엘 암 연구 기금 (ICRF), (GIF 지원됩니다 ), 미국 – 이스라엘 Binational 과학 재단 (BSF), 독일 – 이스라엘 프로젝트 협력 (DIP), 그리고 과학 건강의 이스라엘 부처와 바 – 일란 대학에서 생명 과학의 제인 스턴 Lebell 패밀리 연구원입니다. YB는 Azrieli 활동의 수상 Azrieli 재단에 감사합니다.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
References
- Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
- Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
- Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
- Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
- Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
- Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
- Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
- Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
- Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
- Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
- Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
- Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
- Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
- Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
- Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
