Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single
Summary
Cinética de RNA polimerase II transcricional são medidos em genes específicos em células vivas. mRNAs transcritos do gene de interesse são fluorescente etiquetado e usando a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) o vivo na cinética de alongamento transcricional são obtidos.
Abstract
A atividade transcricional da RNA polimerase II (Pol II) é um processo dinâmico e, portanto, a medição da cinética do processo de transcrição in vivo é importante. Pol cinética II foram medidos utilizando métodos bioquímicos ou moleculares. 1-3 Nos últimos anos, com o desenvolvimento de novos métodos de visualização, tornou-se possível seguir a transcrição como ocorre em tempo real em células vivas único. 4 Aqui nós descrevemos como para realizar a análise de Pol II alongamento cinética em um gene específico nas células vivas. 5, 6 Usando uma linha de célula na qual um locus gene específico (DNA), seu produto mRNA, eo produto final pode ser a proteína fluorescente etiquetado e visualizados in vivo , é possível detectar a transcrição de mRNAs real sobre o gene de interesse. 7, 8 O mRNA é fluorescente etiquetado com o sistema MS2 mRNAs para marcação in vivo, onde o 3'UTR de transcritos no mRNA de conter 24 MS2 haste-laço repete, que fornecem altamente específicos sítios de ligação para a proteína casaco YFP-MS2 que rotula o mRNA como é transcrito. 9 Para monitorar a cinética de transcrição usamos a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) método. Por fotobranqueamento as transcrições YFP-MS2-tagged nascente no local da transcrição e, em seguida, após a recuperação deste sinal ao longo do tempo, obtemos a taxa de síntese dos mRNAs recém-feitos. 5 Em outras palavras, YFP-MS2 recuperação de fluorescência reflete a geração de novos MS2-tronco-loops nas transcrições nascente e sua ligação por fluorescentes YFP-MS2 livre moléculas entrem a partir do nucleoplasma circundante. As curvas de recuperação FRAP são então analisados por modelos mecanicistas matemática formalizada por uma série de equações diferenciais, a fim de recuperar os parâmetros de tempo cinética de transcrição.
Protocol
Discussion
O método para medir a atividade da polimerase cinética em células vivas podem ser divididos em duas partes. A primeira parte descreve o procedimento de "molhado", que permite a medição e recuperação dos dados cinéticos de transcrição de mRNA, enquanto que na segunda parte, os dados são analisados utilizando um modelo de ODE. 5 A série de estudos têm agora utilizada esta abordagem para extrair cinética de transcrição em células vivas 5, 6, 8, 12-14. A principal difer…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS-T é apoiada pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC), o Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Cancer Research Fund Israel (ICRF), alemão-israelense Fundação para Pesquisa e Desenvolvimento Científico (GIF ), EUA-Israel Binacional Science Foundation (BSF), alemão-israelense Projeto de Cooperação (DIP), e os ministérios israelenses de Ciência e Saúde, e é o Jane Stern Fellow Família Lebell em Ciências da Vida da Universidade Bar-Ilan University. YB é grato à Fundação Azrieli para a atribuição de uma bolsa Azrieli.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
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