РНК-полимеразы II транскрипционных кинетики измеряются на определенных генов в живых клетках. мРНК транскрибируется из генов, представляющих интерес, флуоресцентно меченых и с помощью флуоресцентной Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) в естественных условиях кинетика транскрипционных удлинения получены.
Транскрипционной активности РНК-полимеразы II (Пол II) представляет собой динамический процесс, и поэтому измерения кинетики транскрипционного процесса в естественных условиях имеет важное значение. Pol II кинетики была измерена с помощью биохимических или молекулярных методов. 1-3 В последние годы с развитием новых методов визуализации, это стало возможным следовать транскрипции, как это происходит в реальном времени в единый живых клеток. 4 Здесь мы описываем, как проводить анализ Pol II удлинение кинетики на конкретный ген в живые клетки. 5, 6 Используя линию клеток, в которых конкретные локуса гена (ДНК), его мРНК продукта и конечного продукта белок может быть флуоресцентно меченных и визуализируется в естественных условиях , то можно обнаружить фактическое транскрипции мРНК на интересующего гена. 7, 8 мРНК флуоресцентно меткой использованием MS2 системы для мечения РНК в живом организме, где 3'UTR мРНК стенограммы содержат 24 MS2 стволовых петля повторы, которые обеспечивают высокую конкретные сайты связывания для YFP-MS2 белка оболочки, которая маркирует мРНК как транскрибируется 9. Для контроля кинетики транскрипции мы используем флуоресценции Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) метод. По фотообесцвечивания YFP-MS2-меткой нарождающегося стенограммы на сайте транскрипции и затем, после восстановления этого сигнала с течением времени, мы получаем скорость синтеза мРНК новоиспеченных 5. Другими словами, YFP-MS2 флуоресценции восстановления отражает поколения новых MS2 стволовых петель в зарождающейся стенограмм и их связывания флуоресцентных свободной YFP-MS2 молекул, поступающих из окружающей нуклеоплазмы. Кривые восстановления FRAP которые затем анализируются с помощью математических моделей механистической оформляется серии дифференциальных уравнений, для того, чтобы получить кинетических параметров время транскрипции.
Метод измерения кинетической полимеразной активности в живых клетках может быть разделена на две части. Первая часть описывает «влажным» процедура, которая дает возможность измерения и извлечения из кинетических данных транскрипции мРНК, тогда как во второй части, данные анализиров?…
The authors have nothing to disclose.
YS-T поддерживает Европейский исследовательский совет (ERC), Израиль Science Foundation (ISF) (250/06), ХОЯТ-бикура, Израиль онкологический научный фонд (ICRF), германо-израильского фонда научных исследований и развития (GIF ), США-Израиль Двусторонней научный фонд (ЧФ), германо-израильского проекта сотрудничества (DIP), а также израильским министерствами науки и здравоохранения, и Джейн Стерн Lebell семьи научный сотрудник в области наук о жизни в университете Бар-Илан. YB благодарит Фонд Азриэли для присуждения стипендии Азриэли.
Name of the reagent | Company |
---|---|
Doxycycline | Sigma |
FuGENE 6 transfection reagent | Roche |