La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo
Summary
ARN polimerasa II cinética de transcripción se miden en genes específicos en células vivas. ARNm transcrito a partir del gen de interés están marcados con fluorescencia y el uso de recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP), la vivo en la cinética de la elongación de la transcripción se obtienen.
Abstract
La actividad transcripcional de la ARN polimerasa II (pol II) es un proceso dinámico y por lo tanto la medición de la cinética del proceso de transcripción en vivo es de suma importancia. Pol cinética II se han medido con métodos bioquímicos o moleculares. 3.1 En los últimos años, con el desarrollo de nuevos métodos de visualización, se ha hecho posible seguir la transcripción, ya que se produce en tiempo real en células vivas individuales. 4 Aquí se describe cómo para llevar a cabo análisis de Pol II cinética de elongación en un gen específico en las células vivas. 5, 6 Uso de una línea celular en el que puede ser un lugar determinado gen (ADN), su producto de ARNm, y el producto final de proteína marcados con fluorescencia y se visualizan en vivo , es posible detectar la transcripción real de ARNm en el gen de interés. 7, 8 El ARNm es marcado con fluorescencia utilizando el sistema MS2 de ARNm marcado en vivo, donde el 3'UTR de las transcripciones de ARNm contiene 24 MS2 tallo-bucle repite, que ofrecen los sitios de unión altamente específica para la proteína de la cubierta YFP-MS2 que las etiquetas de los ARNm que se transcribe. 9 Para controlar la cinética de la transcripción se utiliza la recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) método. Por las transcripciones photobleaching YFP-MS2-etiquetados naciente en el sitio de la transcripción y luego, tras la recuperación de esta señal a través del tiempo, se obtiene la tasa de síntesis de los ARNm recién hecho. 5 En otras palabras, YFP-MS2 recuperación de fluorescencia refleja la generación de de nuevo MS2 tallo de bucles en las transcripciones naciente y su unión por fluorescencia YFP-MS2 moléculas libres de entrar en el nucleoplasma circundante. Las curvas de recuperación FRAP se analizan mediante modelos matemáticos mecanicista formalizado por una serie de ecuaciones diferenciales, con el fin de recuperar los parámetros de tiempo de cinética de la transcripción.
Protocol
Discussion
El método para medir la actividad de la polimerasa cinética en las células vivas se pueden dividir en dos partes. La primera parte describe el "húmedo" procedimiento que permite la medición y la recuperación de los datos cinéticos de la transcripción del mRNA, mientras que en la segunda parte, los datos se analizaron mediante un modelo de ODE. 5 Un número de estudios han utilizado este enfoque para la extracción de cinética de transcripción en las células vivas 5, 6, 8, 12-14.</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS-T con el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (CEI), la Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF bikura, Israel Cancer Research Fund (ICRF), alemán-israelí Fundación para la Investigación Científica y Desarrollo (GIF ), EE.UU.-Israel Binacional Science Foundation (BSF), Alemania e Israel Cooperación Proyecto (DIP), y los ministerios israelíes de Ciencia y Salud, y es el compañero Jane Stern Familia Lebell en Ciencias de la Vida Humana en la Universidad Bar Ilán. YB agradece a la Fundación Azrieli para la concesión de una beca de Azrieli.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
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