Att mäta kinetiken av mRNA-transkription i enskilda levande celler
Summary
RNA-polymeras II transkriptionell kinetik mäts på specifika gener i levande celler. mRNA transkriberas från genen av intresse är fluorescerande taggade och med hjälp av fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) in vivo kinetiken av transkriptionell töjning erhålls.
Abstract
Den transkriptionell aktiviteten av RNA-polymeras II (Pol II) är en dynamisk process och därför mäta kinetiken av transkriptionell process in vivo är av betydelse. Pol II kinetik har mätts med hjälp av biokemiska och molekylära metoder. 1-3 Under de senaste åren med utveckling av nya visualiseringsmetoder, har det blivit möjligt att följa transkription som det sker i realtid i enskilda levande celler. 4 Häri beskriver vi hur att utföra analyser av Pol II töjning kinetik på en specifik gen i levande celler. 5, 6 Använda en cellinje där en specifik gen lokus (DNA), dess mRNA produkt, och den slutliga proteinprodukter kan fluorescerande och visualiseras in vivo är det möjligt att upptäcka den verkliga transkriptionen av mRNA för genen av intresse. 7, 8 mRNA fluorescerande är taggade med MS2 systemet för märkning mRNA in vivo, där 3'UTR av mRNA transkript innehåller 24 MS2 stam-loop upprepar, som ger mycket specifika bindningsställen för YFP-MS2 päls protein som etiketter mRNA som det är transkriberas. 9 För att övervaka kinetik transkriptionen vi använder fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP)-metoden. Genom fotoblekning den YFP-MS2-märkta gryende avskrifter på platsen för transkription och sedan följa återvinning av denna signal över tiden, vi får syntesen graden av de nygjorda mRNA. 5 Med andra ord speglar YFP-MS2 fluorescens återhämtning generering av nya MS2 Stem-loopar i den framväxande avskrifter och deras bindande genom fluorescerande gratis YFP-MS2 molekyler kommer in från de omgivande nucleoplasm. Den FRAP återhämtning kurvorna analyseras sedan med hjälp av matematiska mekanistiska modeller formaliseras genom en serie av differentialekvationer, för att hämta den kinetiska tidsparametrar för transkription.
Protocol
Discussion
Metoden för mätning av polymeras kinetisk aktiviteten i levande celler kan delas in i två delar. Den första delen beskriver den "våta" förfarande som gör det möjligt att mäta och hämta den kinetiska data av mRNA transkriptionen, medan den andra delen är data analyseras med en ODE-modellen. 5 Ett antal studier har nu utnyttjat denna metod för att extrahera transkription kinetik i levande celler 5, 6, 8, 12-14. Den stora skillnaden mellan dessa studier var hur FRAP återhämtnin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS-T stöds av Europeiska forskningsrådet (ERC), Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israel Cancer Research Fund (ICRF), tysk-israeliska stiftelse för vetenskaplig forskning och utveckling (GIF ), USA-Israel binationella Science Foundation (BSF), tysk-israeliska Projekt Samarbete (DIP), och den israeliska ministerier för vetenskap och hälsa, och är den Jane Stern Lebellska Familj Fellow i livsvetenskaper vid Bar-Ilan University. YB är tacksam för Azrieli Stiftelsen för tilldelning av ett Azrieli gemenskap.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
References
- Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
- Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
- Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
- Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
- Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
- Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
- Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
- Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
- Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
- Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
- Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
- Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
- Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
- Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
- Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
