Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm
Summary
RNA polimeraz II transkripsiyonel kinetiği canlı hücrelerin belirli genlerin ölçülür. ilgi gen transkripsiyonu mRNA'ların floresan etiketli ve (sıkı bağlamak) in vivo kinetiği transkripsiyonel uzama elde edilir Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak.
Abstract
RNA polimeraz II (Pol II) transkripsiyonel aktivitesini dinamik bir süreçtir ve bu nedenle in vivo transkripsiyonel sürecin kinetiği ölçülmesi önem taşımaktadır . Pol II kinetiği, biyokimyasal ve moleküler yöntemler kullanılarak ölçüldü 1-3, son yıllarda yeni görüntüleme yöntemlerinin gelişmesi ile, gerçek zamanlı olarak tek bir canlı hücreler olarak ortaya çıkar transkripsiyon takip etmek mümkün hale gelmiştir 4 Burada nasıl tarif belirli bir gen lokusu (DNA), mRNA ürün ve nihai bir protein ürünü floresan etiketli ve in vivo görüntülendi hangi bir hücre satırını kullanarak canlı hücrelerin belirli bir gen Pol II uzaması kinetik analizi gerçekleştirmek için 5, 6 mRNA'ların gerçek transkripsiyon, ilgi gen tespit etmek mümkündür. 7, 8 mRNA floresan in vivo, mRNA transkript 3'UTR 24 MS2 kök-loop içeren, etiketleme mRNA'ların MS2 sistemi kullanılarak etiketlenir mRNA transkripsiyonu gibi etiketler YFP MS2 kat protein bağlama bölgeleri için son derece özel sağlar tekrarlar, 9 (sıkı bağlamak) yöntemi Photobleaching sonra Floresan Kurtarma transkripsiyon kinetiği izlemek için. Transkripsiyon yerinde YFP-MS2 etiketli doğmakta olan transkript photobleaching ve sonra zamanla bu sinyal kurtarma, yeni yapılan mRNA'ların sentezi oranı edinin. 5. Diğer bir deyişle, YFP-MS2 floresan kurtarma nesil yansıtır , yeni MS2 doğmakta olan transkript ve floresan YFP-MS2 çevreleyen çekirdek plazması giren moleküller tarafından, bağlayıcı kök döngüler. Daha sonra sıkı bağlamak kurtarma eğrileri, transkripsiyon kinetik parametreleri almak için, diferansiyel denklemlerin bir dizi resmiyet matematiksel mekanik modelleri kullanılarak analiz edilmektedir.
Protocol
Discussion
Canlı hücreler polimeraz kinetik aktivitesini ölçmek için yöntem iki bölüme ayrılabilir. Ilk bölümü, ikinci bölümünde, veri ODE model kullanılarak analiz ise, ölçüm ve mRNA transkripsiyon kinetik verileri almak 'ıslak' prosedürü açıklamaktadır. 5 ayıklamak için bir dizi çalışma yaklaşımıdır canlı hücreler 5, 6, 8, 12-14 transkripsiyon kinetiği. Bu çalışmalar arasında en önemli fark, sıkı bağlamak kurtarma eğrisi kinetik parametreleri dönüştü…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YS-T için Almanca-İsrail Bilimsel Araştırma ve Geliştirme Vakfı, Avrupa Araştırma Konseyi (ERC), İsrail Bilim Vakfı (ISF) (250/06), ISF Bikura, İsrail Kanser Araştırma Fonu (ICRF), (GIF tarafından desteklenmektedir ), ABD-İsrail Binational Bilim Vakfı (BSF), Alman-İsrail Projesi İşbirliği (DIP), İsrail Bilim ve Sağlık Bakanlıkları, Bar-Ilan Üniversitesi Yaşam Bilimleri Jane Stern Lebell Aile Üyesi. YB, bir Azrieli dostluk ödül için Azrieli Vakfı minnettardır.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Doxycycline | Sigma |
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche |
References
- Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
- Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
- Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
- Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
- Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
- Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
- Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
- Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
- Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
- Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
- Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
- Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
- Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
- Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
- Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
