1. Fabricação e Montagem Coloque o dissipador de calor de alumínio dentro do 22,96 centímetros (9 ") pie pan aproximadamente 2 cm do lado da panela, como mostrado na Figura 1c Usando uma caneta preta, marque os orifícios para o dissipador de calor de alumínio Nota:.. Se o alumínio bloco (comprado em uma loja local de sucata de metal ou online em http://www.onlinemetals.com ) não vem com furos pré-perfurados, você terá que providenciar a furos e rebaixada antes da etapa 1 para assegurar o alumínio bloco para o pan torta. Costumávamos 5 furos para fixar o bloco para a plataforma e 4 furos extra para permitir bolhas de gás nitrogênio para escapar sob o alumínio. Coloque a caixa crio grade perto do local do dissipador de calor de alumínio e marcar o entalhe e cada lado. Faça furos piloto para cada posição marcada com um bit # 17 broca para o alumínio furos do dissipador de calor e um pouco # 35 broca para os furos de crio-grade de caixa. Montar o dissipador de calor de alumínio com 5 – # 10, 1,9 cm (3 / 4 ") de cabeça chata parafusos de fenda e porcas correspondentes, bem como 15 – # 10 arruelas Coloque duas arruelas sob o bloco de alumínio ea terceira na parte traseira do. pie pan para cada buraco Nota:. overhangs inseguros do bloco de alumínio próximo a área de visualização pode resultar em vibrações que limitam a capacidade de imagem do palco Verifique se todos os parafusos de fixação estão bem apertados.. Inserir 3 – # 4, 0,95 cm (3 / 8 ") completam os parafusos e porcas slotted correspondente da parte traseira da bandeja da torta para atuar como o crio-grade caixa de montagem. Tape 4 pauzinhos juntos em pares com um pauzinho em cima de outro. Par de fita para cada margens opostas do pan bolo para atuar como espaçadores. Superfície molhada superior e inferior do bolo e torta de panelas, respectivamente, com DDH 2 O. Encha a bandeja de bolo com duas camadas de espuma isolante spray. Molhar cada camada antes de ir para a próxima etapa. Pressione a bandeja da torta na espuma. Virar as panelas de cabeça para baixo e pressione no pan bolo até os espaçadores em contato com o pan torta. Coloque qualquer objeto pesado em cima da bandeja de bolo e deixe descansar durante a noite para a cura. Com uma faca serrilhada, corte o excesso de spray de espuma isolante secas a partir da borda das panelas e remover os pauzinhos. Retire a panela do bolo da bandeja da torta. O pan torta com dissipador de calor de alumínio é agora isolado e será referido como o "estágio criogênico" (Fig. 1a). Coloque uma prancheta de plástico transparente (qualquer cor e superior a 3 mm de espessura) sobre a parte superior do palco criogênicos. Marca com um marcador preto a localização da caixa de montagem crio-grade por desenhar um círculo de aproximadamente 1,5 vezes o diâmetro de uma única rodada crio grid-caixa. Cortar buraco com um 1,9 centímetros (3 / 4 ") buraco viu. Esta área de transferência será referida como a" tela de carregamento "(Fig 1b). Coloque uma nova área de transferência transparente em cima do palco criogênico e colocar no microscópio com o dissipador de calor diretamente sob as lentes objetivas. Com um marcador preto, marca o caminho dos objectivos enquanto giram. Corte ao longo da linha marcada a remoção de um meio círculo da borda da área de transferência. Isso pode ser feito com um quebra-cabeças ou utilizando um 7,62 centímetros (3 ") buraco viu várias vezes, como mostrado no vídeo. Finalmente um furo 1,9 cm (3 / 4 ") de distância do meio círculo, mas ainda dentro da área do prato. Esta será a porta para recarga de nitrogênio líquido (LN 2) se os níveis de queda, enquanto imagem. Esta área de transferência serão encaminhados como a "tela de visualização" (Fig 1c). 2. Preparação da Amostra Diluir células log fase de levedura cultivadas em sintético completa (SC) de mídia a uma concentração adequada de 1×10 6 células / mL em água. 2 mL da levedura diluída são pipetados em um R2 / 1 400 mesh de carbono revestido de cobre holey Cryo-EM grade (SPI Supplies, West Chester, PA) e permitiu a absorver por 15 segundos. Blot afastado o excesso de líquido da superfície da grade tocando na parte de trás da grade para um pedaço de tecido de celulose moles (Kimwipe) por 2 segundos. Se necessário, a grade pode ser lavado com 3 gotas l de água (1-3 vezes), e maus longe como no passo 3 por blotting da parte de trás. Antes da lavagem final, a amostra é carregado no freezer mergulhar pneumático ea grade pendurado é lavado como no passo 2.4. Depois de mata-borrão a grade com lenço de papel rasgado (Kimwipe) para remover a maioria da água da superfície, a grade é mergulhado em lN 2 etano líquido resfriado e transferido para uma caixa de crio-grade para armazenamento Nota 1:. É importante deixar uma camada de líquido o mais fino possível na superfície para manter a amostra hidratada. Indevido blotting vão quer secar a amostra ou deixar de gelo que é opaca para o feixe de elétrons. 3. Cryo-Light Microscopy Preencha o estágio criogênico comlN 2 e cobrir rapidamente com a tela de carregamento (área de transferência de plástico com um único 1,9 cm (3 / 4 ") buraco). Uma vez que o metal atinge lN temperatura 2, transferir a caixa crio grade por meio de 1,9 cm (3 / 4 ") buraco da tela de carregamento e na transferência de montagem criada pela 3 parafusos descrito na A5 parte. Desaperte a caixa de crio-grade de seu titular e remova o suporte para um melhor acesso. Mantenha a caixa de titular crio grade sob lN 2 em um dewar separadas até a etapa 3.10. A caixa de crio-grade também devem ser mantidos sob lN 2 a prevenir o aquecimento grade amostra. . Recarga lN 2 no estágio criogênico para logo abaixo do topo do dissipador de calor de alumínio Nota: lN dois níveis devem ser verificados periodicamente e recarregado durante o processo de imagem para garantir lN 2 é continuamente em contato com o dissipador de calor. Em geral, a recarga ocorre a cada 10 minutos através da porta de preencher a tela de visualização. Pré-cool ponta da pinça em lN 2, em seguida, transferir sua grade (s) sobre a superfície de visualização plana do dissipador de calor de alumínio, com uma pinça, usando o 1.9 cm (3 / 4 ") buraco da tela de carregamento. Mover cuidadosamente o crio-estágio para debaixo aberturas objetivo do microscópio de luz refletida. Coloque a tela de visualização transparente no topo da tela de carregamento. Em seguida, lentamente, remova a tela de carregamento, deslizando-lo debaixo do ecrã de visualização. Nota: Neste ponto, a amostra é mais vulneráveis. Todas as correntes de ar ao redor do microscópio deve ser minimizada, incluindo: respiração, uma abertura de porta próxima, as pessoas passando, etc Sugerimos vestindo uma máscara ou pendurando uma viseira transparente abaixo do oculares do microscópio como medida de precaução. Gire a lentes objetivas no ambiente frio de nitrogênio gás do crio-estágio e digitalização para a amostra na área de visualização plana do dissipador de calor. Usando o padrão brilhante luz de microscopia de campo foco técnicas no grid com um objectivo de baixa ampliação para encontrar o centro e ter uma imagem panorâmica. Especificações sobre as lentes de microscopia de luz utilizada para este experimento estão listados na seção Materiais Experimental. Nota: lN dois não entram em contato com as lentes objetiva e ainda temos de ver a degradação de imagens ou dano às lentes dos efeitos do resfriamento . Foco em alta ampliação em uma área de interesse e adquirir dados com campo claro, campo escuro, luz polarizada ou imagens de fluorescência. Certifique-se de registrar a localização da área de interesse na imagem de baixo campo ampliação brilhante para a correlação de futuro. Se todas as precauções listados acima para a recarga do lN dois são seguidos, então a pressão positiva a partir do nitrogênio evaporação é suficiente para manter um ambiente livre de contaminação (independente da umidade ambiente) para a duração da imagem. Uma vez terminado, substituir a tela de carregamento, deslizando-a sobre a parte superior da tela de visualização. Remova a tela de visualização, diminuindo deslizando-a por baixo da tela de carregamento. Remover o estágio crio a partir do microscópio e com pré-resfriada pinças, transferir a grade de volta para a caixa de crio-grade. Parafuso do titular caixa crio grade em crio-grade caixa para selar contra o meio ambiente e transferência do titular para um dewar LN2 para armazenamento e imagem futuro. 4. Cryo-Electron Microscopy Seguintes técnicas padronizadas e estabelecidas, carregar a grade de amostra em um suporte de transferência de crio-EM, mantendo a amostra à temperatura de nitrogênio líquido em todos os momentos. Insira o crio titular com grade de exemplo em um Microscópio Eletrônico de Transmissão. Em uma visão de ampliação adequado baixo (50-500x de ampliação nominal), encontrar o centro da grade de amostra. Use o previamente coletadas baixa ampliação crio LM-dados a partir do passo 3.7 para determinar a orientação relativa das abas da rede de cobre da central (como descrito na Figura 2) e identificar áreas de interesse para exata correlação. Prosseguir com o alinhamento microscópio, baixa dose de crio-EM de imagem e de coleta de dados. 5. Resultados representante O estágio criogênico (Fig 1a) é uma maneira eficaz de reunir crio-LM de dados para crio-fluorescência microscopia e análise cryo-LM/cryo-EM correlativos. A Figura 2 mostra como a combinação de baixa e alta ampliação crio-LM imagens permite construir mapas de referência que direcioná-lo para áreas específicas em crio-EM. O resultado crio-LM mapa de referência (Fig. 2b) foi utilizado durante a Cryo-EM aquisição de dados para localizar as regiões exata mostrada na Figura 3. Figura 1. Stage criogénicos. A) A disposição do palco criogênico consiste de uma caixa de transferência de crio-grade montagem indicada wseta om um branco e um dissipador de calor de alumínio. Grids são transferidos sob lN 2 da caixa de crio-grade e colocado diretamente sobre a área de visualização do dissipador de calor como indicado pela seta preta. B) Imagem representando o estágio criogênico com carga tela. O buraco na tela de carregamento é colocado diretamente sobre a crio-grade caixa de montar e funciona como uma porta para transferir as amostras e para o transporte de amostras a partir da caixa crio-grade para a área de amostra visualização no dissipador de calor com uma pinça. C) O criogênicos estágio na posição sob as lentes objetivas com a tela de visualização no lugar. O recorte especial na tela de visualização permite que as lentes objetivo de facilitar a troca na posição sem mover o estágio criogênico. O buraco na tela de visualização de distância da área de amostra funciona como um lN dois preencher porto para reabastecer lN 2 níveis, se necessário. Figura 2. Navegando em crio-LM para estudos correlativos. A) baixa ampliação vista crio LM-de células de levedura aderiram a uma grade de amostra. B) A mesma imagem em (a) revestidas com uma imagem de alta ampliação de fluorescência de uma área de interesse e com um polígono preenchido laranja que marca o centro da grade da amostra. O centro é composto de um grupo de quatro quadrados, três tendo um guia de metal extra e o quarto aberto. Para os três quadrados com uma guia de metal extra, dois pares de partes do guia sobre os eixos longo e curto formando um centro assimétrico. Este centro assimétrico pode ser visto no canto superior esquerdo e foi usado para indicar o ângulo de rotação e lateralidade da grade entre crio-LM e crio-EM. Áreas de uma imagem de baixa ampliação muitos dos juros pode ser marcada e usada como um mapa de referência para localizar áreas idênticas em crio-EM. C) A imagem ampliada de fluorescência crio-LM da área de interesse em (b). HTA1-PCP, um c-terminal marcador PCP histona, pode ser visto como uma estrutura verde punctate rotulagem a localização do núcleo. D) Uma imagem Cryo-EM da área correspondente em (c). Barras de escala representam 50 microns. Figura 3. Correlação de crio-LM e crio-EM. Dois campos de vista mostrando células de levedura idênticos correlacionada com crio-brilhante campo (um d), crio-fluorescência (b, e), e crio-EM (c, f bares). Scale representam 5 microns.