Düşük Maliyetli Cryo-Işık Mikroskopi Sahne İmalatı İlişkili Işık / Elektron Mikroskopi

Summary

Biz en çok yansıyan ışık mikroskopları uyacak şekilde tasarlanmış düşük maliyetli kriyojenik sahne imalat göstermektedir. Bu laboratuvar dahili kriyojenik aşamada cryo-ışık ve cryo-elektron mikroskobu arasındaki verimli ve güvenilir bir bağlaşık görüntüleme sağlar.

Abstract

Cryo ışık mikroskobu (cryo-LM) ve kriyo-elektron mikroskobu kavrama (cryo-EM) hücresel dinamikleri ve ultrastrüktür anlamak için bir çok avantaj teşkil etmektedir. İlk olarak, hücreler her iki teknikleri için yakın bir doğal ortamda görüntülü olabilir. Vitrifikasyon süreci nedeniyle, ikinci numunelerin hızlı fiziksel immobilizasyon ziyade yavaş kimyasal sabitleme tarafından korunur. Üçüncü olarak, görüntüleme cryo-LM ve cryo-EM ile aynı örnek, "temsili numuneler" bir karşılaştırma yerine, tek bir hücre veri korelasyon sağlar. Bu faydalar, önceki çalışmalardan elde edilen iyi bilinen edilirken, bağlaşık cryo-LM ve cryo-EM kalır yaygın kullanımı, satın alma ya da uygun bir kriyojenik ışık mikroskobu sahne binasının gider ve karmaşıklığı nedeniyle sınırlı. Burada montaj göstermek ve yerel donanım ve bakkallarda bulunan parçalar ile 40 $ 'dan az herhangi bir laboratuarda imal edilebilir bir ucuz kriyojenik sahne kullanımı. Bu cryo-LM aşaması uzun çalışma mesafesi hava hedefleri ile donatılmış yansıyan ışık mikroskopları ile kullanmak için tasarlanmıştır. Bağıntılı cryo-LM ve cryo-EM çalışmaları için, biz örnek destekleyen olarak karbon kaplı standart 3 mm cryo-EM ızgaraları kullanmak uyum sağlar. Izgara örnek adsorblama sonra, örnek sırlama ve aktarma / ızgara taşınması için daha önce belirlenmiş protokoller çok tekniği görüntüleme izni için takip edilmektedir. Sonuç olarak, bu kurulum yansıyan bir ışık mikroskobu ile, herhangi bir laboratuvar dondurulmuş sulu örneklerin doğrudan bağıntılı görüntüleme erişim sağlar.

Protocol

1. Imalat ve montaj Şekil 1c gösterildiği gibi. 22,96 cm (9 ") pasta pan pan tarafında yaklaşık 2 cm, siyah bir marker kalem, alüminyum heatsink işareti delikleri Not kullanma içinde alüminyum heatsink Yeri: Eğer alüminyum blok (yerel bir hurda metal dükkanı veya çevrimiçi satın http://www.onlinemetals.com ) ön delikli gelmez, delik delinmiş ve alüminyum güvence altına almak için 1 adım önce gömme düzenlemek için ihtiyacınız olacak pasta tava blok nitrojen gaz kabarcıkları alüminyum altından kaçmasına izin için, platform ve 4 ekstra delikler blok güvence altına almak için 5 delik. Alüminyum ısı lavabonun bulunduğu yere yakın cryo-grid kutusu yerleştirin ve çentik ve her iki tarafın işareti. Alüminyum heatsink delikler için, # 17 matkap ucu ve # 35 cryo-Grid kutusu delikler için bir matkap ucu kullanarak her işaretli pozisyon için pilot delikler delin. Mount 5 kullanılarak alüminyum heatsink – # 10, 1.9 cm (3 / 4 ") düz kafa oluklu cıvata ve uygun somun gibi 15 – # 10 pullar iki alüminyum blok altında pullar ve arka üçüncü. Her delik Not pasta tava izleme alanı yakınında alüminyum blok Teminatsız çıkıntılar sahne görüntüleme yetenekleri sınırı titreşimler neden olabilir: Tüm montaj cıvataları iyice sıkılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Takın 3 – # 4, 0.95 cm (3 / 8 ") arka cryo-ızgara kutusu montajı olarak hareket pasta tava, oluklu cıvata ve ilgili fındık yuvarlak. 4 çubuklarını başka bir tepesinde bir Çubuk ile çiftleri birlikte Teyp. Kek tavada ters kenarlarına Şerit ayırıcılar olarak hareket etmek her çift. Islak kek ve pasta alt ve üst yüzey GKD 2 O. ile sırasıyla tava Sprey köpük yalıtım iki kat kek tava ile doldurun. Sonraki adıma geçmeden önce her bir katmanı Islatma. Köpüğe pasta tava basın. Tava baş aşağı çevirin ve ayırıcılar pasta tava başvurun kadar kek tava basın. Kek tava tepesinde herhangi bir ağırlıklı nesne yerleştirin ve tedavi etmek için bir gece bekletin. Tırtıklı bıçak ile, aşırı kuru tava kenarından sprey köpük yalıtım kesip çubuklarını kaldırmak. Kek pasta pan pan çıkarın. Alüminyum ısı lavabo pasta tava şimdi yalıtılmış ve "kriyojenik sahne" (Şekil 1a) olarak sevk edilecektir. Kriyojenik sahne üstünden şeffaf plastik bir panoya (herhangi bir renk ve daha fazla 3 mm kalınlığında) yerleştirin. Siyah bir işaret, tek bir turda cryo-grid çapı yaklaşık 1.5 kat bir daire çizerek cryo-ızgara kutusu montaj konumu ile işaretleyin. 1.9 cm (3 / 4 ") kesip delik delik gördüm. Bu panoya olarak sevk edilecektir" yükleme ekranı "(Şekil 1b). Kriyojenik sahne ve objektif lensleri altında doğrudan ısı lavabo mikroskop yer tepesine yeni bir şeffaf panoya koyun. Döndürme gibi siyah bir belirteç ile hedeflerin yolunu işaretleyin. Pano kenarından bir yarım daire çıkarmadan işaretlenen hat boyunca kesin. Bu bir yapboz veya video gösterildiği gibi delik birden çok kez gördüm 7,62 cm (3 ") kullanılarak yapılabilir. Sonunda çanağı alanı içinde yarım daire uzakta ama yine de 1.9 cm (3 / 4 ") delik kesti. Seviyeleri düşer görüntüleme Bu panoya sevk edilecektir ise sıvı azot dolumu (LN 2) Bu bağlantı noktası olacak "izleme ekranı" (Şekil 1c). 2. Numune Hazırlama 1×10 6 hücre / mL su uygun bir konsantrasyon sentetik tam (SC) medya yetişen günlük faz maya hücreleri sulandırınız. Seyreltilmiş maya 2 mL R2 / 1 400 örgü holey karbon kaplı bakır cryo-EM ızgara (SPI Malzemeleri, West Chester, PA) üzerine pipetlenebilir ve emilmesi için 15 saniye izin verilir. 2 saniye için yumuşak selüloz doku yırtılmış parça (Kimwipe) ızgara arkasına dokunarak ızgara yüzeyinden uzakta aşırı sıvı Blot. Gerekirse, ızgara, 3 su damlaları mcL (1-3 kez), ve kötü uzakta 3. adımda arka blot ile yıkanmalıdır. Son yıkama önce, örnek pnömatik dalma dondurucu içine yüklenen ve asılı ızgara adım 2.4 gibi yıkanır. Su yüzeyinden çoğunluğu kaldırmak için yırtık kağıt mendil (Kimwipe) ızgara blot sonra, ızgara sıvı etan soğutmalı LN 2 içine daldı ve bir depolama Not 1 cryo-grid kutusuna aktarılır: önemlidir. numune nemli tutmak için, mümkün olduğunca ince sıvı bir tabaka yüzeyde bırakın. Yanlış blot ya örnek kurumasına veya elektron ışını opak buz terk edecektir. 3. Cryo-Işık Mikroskopi Kriyojenik aşaması ile doldurunLN 2 ve hızlı yükleme ekranı ile (1.9 cm (3 / 4 ") tek delik ile plastik panoya) kapsar . Metal parçası A5 açıklanan 3 vida ile monte 1.9 cm (3 / 4 ") yükleme ekranında ve transfer delik içine cryo-grid transfer, LN 2 sıcaklık ulaşır. Sökün cryo-grid onun sahibinin ve iyileştirilmiş erişim için tutucu kaldırmak adım 3.10 kadar ayrı bir Dewar cryo grid sahibi LN 2 altında tutun. cryo-grid kutusu da örnek ızgara ısınmayı önlemek için LN 2 altında tutulmalıdır. Yedek sadece alüminyum ısı lavabo üst altında kriyojenik aşamasında LN 2 Not: LN 2 düzeyleri periyodik olarak kontrol ve LN 2 ısı lavabo ile sürekli temas sağlamak için görüntüleme işlemi sırasında yenilenmeleri gerekir. Genel olarak, dolum görüntüleme ekranı dolgu bağlantı noktası üzerinden her 10 dakikada oluşur. LN 2 Pre-serin cımbız ucu, daha sonra 1.9 cm (3 / 4 ") yükleme ekranı delik kullanarak, cımbız ile alüminyum ısı lavabo düz görüntüleme yüzeye ızgara (ler) aktarmak. Yansıyan ışık mikroskobu objektif diyafram altında dikkatlice cryo aşamalı taşımak. Yükleme ekranı tepesinde şeffaf izleme ekranı yerleştirin. Sonra yavaş yavaş, görüntüleme ekranı Not altına kaydırarak yükleme ekranı kaldırmak: Bu noktada, örnek, en savunmasız. Mikroskop etrafında bulunan tüm hava akımları da dahil olmak üzere minimize edilmelidir: Yakın bir yerde kapı açma, insanlar geçmiş yürüyüş, solunum, vb Biz bir yüz maskesi giymiş veya bir tedbir olarak mikroskop göz mercekleri altında şeffaf bir yüz maskesi asılı öneririz. Cryo kademeli ve düz bir ısı emici izleme alanı örnek için tarama soğuk azot gazı ortama objektif lensleri döndürün. Izgara üzerinde standart parlak bir alan ışık mikroskopi teknikleri odak merkezini bulmak ve genel bir görüntü almak için düşük bir büyütme amacı ile kullanarak. Bu deney için kullanılan ışık mikroskobu lensler ile ilgili Özellikler Deneysel Malzeme bölümünde listelenen Not: LN 2 nesnel lensler ile temas gelmez ve biz, soğutma etkilerinden görüntü veya lenslerin zarar bozulması henüz görmedik. . Bir ilgi alanında yüksek büyütmeli Odak ve aydınlık alan, karanlık alan, polarize ışık veya floresan görüntüleme veri almak. Gelecek korelasyon düşük büyütme parlak bir alan görüntü, ilgi alanın konumunu kaydetmek için emin olun. LN 2 dolumu için yukarıda listelenen tüm önlemleri takip edilirse, daha sonra buharlaşan azot pozitif basınç görüntüleme süresi için bir kontaminasyon ortamda (oda nem bağımsız) korumak için yeterli. Bittiği zaman, yükleme ekranında görüntüleme ekranın üst üzerinde kaydırarak değiştirin. Yükleme ekranının altında kaydırarak yavaşlatarak görüntüleme ekranı çıkarın. Mikroskop cryo sahne çıkarın ve önceden soğutulmuş cımbız, cryo-grid kutusuna geri ızgara transfer. Çevreye karşı mühür ve LN2 Dewar sahibinin, depolama ve gelecekteki görüntüleme için transfer etmek cryo-ızgara kutusu içine cryo grid sahibi vidalayın. 4. Cryo-Elektron Mikroskobu Her zaman sıvı azot sıcaklığında numune tutarken, standart ve yerleşmiş teknikleri, bir cryo-EM transfer sahibinin örnek ızgara içine yerleştirin. Transmisyon Elektron Mikroskobu örnek ızgara ile kriyo sahibi yerleştirin. Uygun bir düşük büyütme (50 500x, nominal büyütme), örnek ızgara merkezinde bulabilirsiniz. Izgara merkezi bakır sekmeleri göreli bir yönünü (Şekil 2'de açıklandığı gibi) belirlemek ve korelasyon için kesin ilgi alanları belirlemek için adım 3,7 'den daha önce toplanan düşük büyütme cryo-LM veri kullanın. Mikroskop hizalama, düşük doz cryo-EM görüntüleme ve veri toplama ile devam edin. 5. Temsilcisi Sonuçlar Kriyojenik aşamada (Şekil 1a) cryo-LM cryo floresan mikroskopi ve bağlaşık cryo-LM/cryo-EM analiz için veri toplamak için etkili bir yoldur. Şekil 2, düşük ve yüksek büyütme cryo-LM görüntüleri kombinasyonu cryo-EM belirli alanlarda doğrudan referans haritalar oluşturmanıza olanak verir nasıl gösterir. Cryo-LM referans haritası (Şekil 2b), Şekil 3'te gösterildiği gibi tam bölgeleri bulmak için cryo-EM veri toplama sırasında kullanılmıştır. Şekil 1 Kriyojenik Sahne) kriyojenik sahne düzeni monte w belirtilen bir cryo-grid transferi oluşuri. beyaz bir ok ve bir alüminyum heatsink. Izgaralar, cryo-grid kutusundan LN 2 kapsamında aktarılır ve siyah ok ile gösterildiği gibi doğrudan ısı emici görüntüleme alanına yerleştirilir. B) Görüntü yükleme ekranı ile kriyojenik sahne betimleyen . Bir liman örnekleri aktarmak ve cımbız ile ısı emici örnek izleme alanı cryo-grid örnekleri hareket c) kriyojenik olarak yükleme ekranı delik cryo-Grid kutusu montaj ve eylemleri üzerinden doğrudan yerleştirilir yerinde izleme ekranı ile objektif lensler altında pozisyon sahne. Görüntüleme ekranında özel kesme nesnel lensler kriyojenik aşamada hareket ettirmeden kolayca yerleştirin salıncak sağlar. Örnek alanın uzak görüntüleme ekranındaki delik LN 2 doldurmak gerekirse LN 2 seviyeleri doldurmak için bağlantı noktası olarak görür. Şekil 2 cryo-LM bağıntılı çalışmalar için gezinme. Maya hücreleri a) Düşük büyütme cryo-LM bir örnek ızgara yapıştırılır. B) 'de aynı görüntü (a) bir ilgi alanı yüksek bir büyütme floresan görüntü ile kaplanmış ve dolu bir portakal çokgen ile örnek ızgara merkezi işareti. Merkezi dört ekstra bir metal sekmesini ve dördüncü açık olan meydanlar, üç bir grup oluşur. Ekstra bir metal sekmesinde üç kare, asimetrik bir merkez oluşturan kısa ve uzun eksenleri hakkında iki çift sekme paylaşın. Bu asimetrik merkez sol üst köşesinde görülebilir ve cryo-LM ve cryo-EM arasında ızgara dönme açısı ve ellilik belirtmek için kullanılır oldu. Faiz, düşük bir büyütme görüntü birçok alanda itibaren işaretlenir ve cryo-EM aynı alanları bulmak için bir referans haritası olarak kullanılır. C), (b) ilgi alanı büyütülmüş floresan cryo-LM görüntü . HTA1-CFP, c-terminal CFP histon işaretleyici, çekirdeğin konum etiketleme yeşil noktalı bir yapı olarak görülebilir. D) karşılık gelen alan cryo-EM görüntü (c) Ölçek bar, 50 mikron temsil eder . Şekil 3 cryo-LM ve cryo-EM Korelasyon aynı maya hücreleri betimleyen iki alan görüş (c, f cryo parlak alan (d), cryo-floresans (b, e) ve cryo-EM ile korele 5 mikron). Ölçek bar temsil eder.

Discussion

<p class="jove_content"> Bizim kriyojenik sahne ve numune hazırlama teknikleri, cryo-LM ve cryo-EM arasında bağıntılı çalışmalar da dahil olmak üzere, ancak bunlarla sınırlı olmayan yaklaşımlar geleneksel oda sıcaklığı üzerinde birçok faydaları sergilerler: hızlı sabitleme^1,2 Photobleaching azaltılmış³ Ve cryo-EM önce örnek bütünlüğünü tarama^4,5 Ya da kimyasal tespiti / gömme⁶. Cryo-EM veri toplama için darboğazlardan biri TEM örnek aktarımı ve görüntü uygun bölgelerde bulmak için ızgaranın her iki tarama için gerekli zaman. Cryo-LM hızlı veri toplama ile⁵ Zaman iyi hücreleri bulmak harcanan büyük ölçüde azaltılabilir. Böylece, hem zaman ve paradan tasarruf ve öncesi tarama ve cryo-LM ilgi alanlarının haritalanması bu darboğaz azaltmak.</p><p class="jove_content"> Daha pahalı ya da karmaşık kriyojenik aşamalarında daha yüksek çözünürlüklü cryo-LM görüntüleme izin verebilir. Ancak, burada fabrikasyon aşamasında daha pek çok uygulama için yeterli. Cryo-LM görüntüleme ve örnek ızgara transferleri metin ve video açıklandığı gibi dikkatle yapılması halinde, tam kirlenme ücretsiz görüntüleme yapılabilir. Bu yöntem, aynı hücre, organel ya da makromoleküler kompleksi floresan ve elektron mikroskobu verileri doğrudan bir ilişki karbon destek dağınık ya da ince bir doku bölümünde içinde yer sağlar⁷. Bu kriyojenik sahne değer bir bütün olarak ışık mikroskobu alanına cryo-LM/cryo-EM korelatif çalışmaların ötesine uzanan dikkat edilmelidir. Bu kriyojenik aşamada hassas örnekleri ve fluorofor boyalar / lekeleri için uygundur⁸ Quantum noktaları veya floresan etiketli proteinlerin⁹ Paraformaldehid glutaraldehit ve oda sıcaklığında kimyasal fiksasyon ve gömme sırasında kararsız olabilir. Sonuç olarak, biz bu kriyojenik aşamada, önce maliyet ve yetersiz erişim deterred edilmiştir cryo-LM, ilgilenenler daha yüksek erişim sağlayacağını umuyorum.</p><p class="jove_content"<em> Sorun Giderme Cryo-Işık Mikroskopi</em</p><p class="jove_content"<em> 1. Örnek Adsorpsiyon:</em> Farklı örnekleri karbon destek değişken adsorbsiyon özellikleri gösterebilir. Destek ızgaraları gibi sürekli karbon, holey karbon veya numune desteği için formvar kaplı ızgaraları gibi diğer türleri kullanmak gerekli olabilir. Ayrıca, örnek ızgara ve karbon yüzey bakır çubuk bağlayıcı ise, karbon yüzey kimyası, ızgara ıslatıcı ile inkübe veya parlaklık örnek ek önce boşaltma ayarlamak için gerekli olabilir.</p><p class="jove_content"<em> 2. Sahne istikrar:</em> Titreşim fark ederseniz, büyük olasılıkla ağırlığı yerine LN2 köpürme aşırı örnek aşamasına kaynaklanmaktadır. Kriyojenik aşamada ek bir ağırlık, bazen düşük frekanslı titreşimleri, standart 3-eksenli seyahat mikroskop sahne boyunca iletmek için neden ve bulanıklık aracılığıyla görüntüleme olumsuz etkileyebilir. Bu videoda gösterildiği gibi, mikroskop altında çift vida silah ile ayarlanabilir bir mini asansör veya ayarlanabilir bir adaptör ile seyahat aşamasında destekleyen kolayca düzeltilebilir. Her ikisi de bu ayarlanabilir destek mekanizmaları seyahat aşamasında olmayan bir hareketli kısmı ile etkileşime girer ve bu nedenle hala görüntüleme için gerekli olarak X ve Y ekseni çeviri izin verir.</p>

Materials

Table of specific reagents and equipment:

Name	Company	Catalog #	Comments	Cost
1 – 22.86 cm (9″) pie pan with sloped edge	Good Cook		Local grocery store	$4.39
1 – 22.86 cm (9″) cake pan	Good Cook		Local grocery store	$4.93
4 pairs of chopsticks			Local grocery store	$.50
1 – Great Stuff spray foam	Great Stuff		Local hardware store	$5.98
1 – 4cm x8cm x1cm block of aluminum			Local hardware store or metal scrap yard	$10.00
5 – #10 1.91 cm (3/4″) flat head slotted bolts w/ nuts			Local hardware store	$0.98
3 – #4 0.95 cm (3/8″) round slotted bolts w/ nuts			Local hardware store	$0.98
15 – #10 washers			Local hardware store	$0.98
2 – transparent plastic clipboards			Local office store	$6.84
1 – Cryo-EM grid box holder	Ted Pella	160-41		N/A
1 – Cryo-EM grid box handling rod	Ted Pella	160-46		N/A
1 – R2/1 holey carbon film, 400-mesh copper cryo-EM support grid	SPI Supplies	4340C-XA		N/A

Experimental materials

1. Yeast strain: Hta1-CFP::Kan (KSC-3382: MATa, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP::KanMX6 from the Kaplan lab at UC Davis).
2. Cryo-Light Microscopy: Cryo-light microscopy images were taken on a Leica DM4000M reflecting microscope with a Leica DFC310 FX CCD camera. Bright Field, Dark Field and Fluorescence images were acquired using either a HCX PL FLUOTAR 5x 0.15 N.A. air objective, a HCX PL FLUOTAR 10x 0.30 N.A. air objective, a PL FLUOTAR 50x 0.55 N.A. air objective or a NPLAN 100x 0.75 N.A. air objective. Bright Field and Dark Field images used a 12V 100W tungsten lamp as the light source. For Fluorescence, an EL6000 UV lamp source was used in conjunction with a Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, D.M.: LP 505, S.F. BP 535/40 & LP 580) Filter Cube.
3. Cryo-Transmission Electron Microscopy: Cryo-EM images were acquired on a JEM-2100-FEG Transmission Electron Microscope (JEOL, Japan) operating at 200 KeV utilizing a Gatan 626 cryo-transfer holder (Gatan, USA). Micrographs were recorded at nominal magnifications of 50, 200, 1,200 and 4,000X on a 4,096 x 4,096 pixel Tietz CCD camera (TVIPS, Gauting, Germany).