الأجرعية بوساطة الفيروسات إسكات الجينات المستحثة الفحص في القطن
Summary
نقدم بروتوكول مفصلة لالأجرعية بوساطة الجينات التي يسببها فيروس مقايسة (VIGS) في إسكات القطن. تم نشر فيروس حشرجة التبغ (TRV) المشتقة VIGS ناقلات للحث على الحمض النووي الريبي إسكات من القطن GrCLA1 ، Cloroplastos alterados 1 الجينات. وقد لوحظ النمط الظاهري البيضاء التي يسببها إسكات GrCLA1 في مرحلة الشتلات في حدود 2 أسابيع بعد التلقيح.
Abstract
القطن (الكرسف أزغب) هي واحدة من أهم المحاصيل في جميع أنحاء العالم. وقد بذلت جهود كبيرة في مجال تربية الجزيئية لأصناف جديدة. وقد تخلفت التحليل الجيني على نطاق واسع وظيفية في القطن وراء معظم الأنواع النباتية الحديث ، على الأرجح بسبب حجمه كبير من الجينات الوراثية من الازدواجية وتعدد الصيغ الصبغية ، طويل دورة النمو والتحول الجيني لتمردات 1. لتسهيل سرعة وظيفية عالية الدراسة الجينية / الجينومية في القطن ، ونحن نحاول تطوير المقايسات عابرة سريعة وفعالة لتقييم وظائف الجينات القطن.
الفيروس المستحثة إسكات الجينات (VIGS) هي تقنية قوية التي تم تطويرها استنادا على المضيف بعد الترانسكربتي إسكات الجينات (PTGS) لقمع الانتشار الفيروسي 2،3. وقد الأجرعية بوساطة VIGS تطبيقها بنجاح في مجموعة واسعة من الأنواع مثل dicots الباذنجانية ، وأنواع البقول Arabidopsis ، والفلقة الأنواع بما في ذلك القمح والشعير والذرة ، لمختلف الدراسات الجينومية الوظيفية 3،4. حيث أن هذا النهج السريع والفعال يتجنب التحول النبات ويتغلب التكرار وظيفية ، ولا سيما انها جذابة ومناسبة للدراسة الجينوم الوظيفي في أنواع المحاصيل مثل القطن غير قابلة للتحول.
في هذه الدراسة ، فإننا تقرير مفصل لنظام بروتوكول VIGS الأجرعية بوساطة في القطن. بين النواقل الفيروسية VIGS عدة ، وسمع دوي فيروس التبغ (TRV) يغزو مجموعة واسعة من المضيفين وغير قادرة على الانتشار في جميع أنحاء بقوة كامل انتاج المصنع بعد أعراض خفيفة على hosts5. لرصد مدى كفاءة إسكات ، GrCLA1 ، وهو الجين homolog من Cloroplastos Arabidopsis alterados 1 الجين (AtCLA1) في القطن ، تم استنساخ وإدراجها في ناقلات ثنائية VIGS pYL156. CLA1 الجين يشارك في عملية التنمية بلاستيدات الخضراء 6 ، ودراسات سابقة قد أظهرت أن أدت الخسارة من وظيفة من AtCLA1 في النمط الظاهري على الأوراق البيضاء 7 صحيحا ، وتوفير علامة بصرية ممتازة لإسكات الكفاءة. في حوالي أسبوعين آخر الأجرعية تسلل ، بدأ النمط الظاهري البيضاء لتظهر على الأوراق الحقيقية ، مع إسكات كفاءة 100 ٪ في جميع التجارب منسوخة. وأكد أيضا على إسكات الجينات الذاتية التي كتبها RT – PCR التحليل. إلى حد كبير ، يمكن أن تحدث أكثر قدرة في إسكات جميع أصناف اختبرناها ، بما في ذلك مختلف أصناف تزرع تجاريا في تكساس. هذا الفحص السريع والفعال VIGS الأجرعية بوساطة يوفر أداة قوية جدا لتحليل واسع النطاق السريع وظائف الجينات في الجينوم واسعة في مستوى القطن.
Protocol
Discussion
وقد ثبت VIGS أن تكون أداة قوية في مجال تحليل الجينوم الوظيفي عابر يطرق باستمرار التعبير عن الجينات المحلية. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير VIGS الأجرعية بوساطة من خلال استخدام ناقل ثنائي TRV مقرا لها. وقد وضعت القطن CLA1 (GrCLA1) كعلامة الجينات البصرية لمراقبة كفاءة إسكات. لق?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للالدكاترة. SP – دينيش كومار وليو لعيد ميلاد المسيح TRV – VIGS النواقل ، والدكاترة. تشوك Kenerley ، تيري ويلر ، وباير جيم ستار CropScience لتوفير بذور القطن. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني ليرة سورية والمعاهد الوطنية للصحة لPH
Materials
| Name of the reagents and equipments | Company | Catalogue/serial number | Comments |
|---|---|---|---|
| Roller drum | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | BioRad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | BioRad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | BioRad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Infiltration buffer |
References
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant J. 31, 777-786 (2002).
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
