真菌内切葡聚糖酶的活性高通量筛选大肠埃希氏菌</em
Summary
我们描述了一种低成本，高通量方法真菌内切葡聚糖酶的活性在屏幕<em> E。大肠杆菌。</em>该方法依赖于一个简单的基质降解的视觉读数，不需要酶的纯化，并高度可伸缩的。这使得酶变异体的大型图书馆的快速筛选。
Abstract
纤维素酶（endoglucanases，cellobiohydrolases，和β-葡萄糖苷酶）水解成组成糖的纤维素，这反过来又可以转换成燃料醇 1 。酶解纤维素生物质来提供可再生能源的潜力，加紧努力，以工程师为经济的燃料生产 2纤维素酶。特别感兴趣的是真菌纤维素酶 3-8，目前已经被用于食品和纺织品加工工业。
确定之间的突变纤维素库积极变种，工程过程是至关重要的;积极的突变体，可进一步测试，性能改进和/或遭受额外的突变。真菌纤维素酶的高效的工程已经阻碍了原生生物体的遗传工具的缺乏和难以表达的酶在异源主机。近日，森川和他的同事开发出一种在大肠杆菌中的表达方法H. jecorina 3,9，一个重要的工业真菌的能力，分泌大量的纤维素endoglucanases大肠杆菌的催化结构域。功能性大肠杆菌中的表达，也为其他真菌的纤维素酶， 包括Macrophomina phaseolina 10 和黄孢原 毛平革 11-12报告。
我们目前在大肠杆菌中的真菌内切葡聚糖酶的活性高通量筛选的方法大肠杆菌 。 （ 图1）此方法使用的常见的微生物染料刚果红（CR），以可视化的羧甲基纤维素（CMC）的固体培养基上生长的细胞的酶降解。酶活性测定需要廉价的试剂，最小操纵，退化区，在殖民地网站（“光环”），并给出明确的结果。虽然酶活性的定量测量，不能用这种方法确定的，我们发现，光环的大小总在细胞内的酶的活性相关。个别阳性克隆进一步鉴定，确定，相对蛋白健身。
CMC / CR传统的细菌全细胞活性测定13涉及泼在琼脂含有CMC的殖民地，这是受交叉污染，或在CMC琼脂井，这是不适合进行大规模的试验培育文化。在这里，我们报告的改进协议，修改现有14纤维素酶洗方法：CMC琼脂平板上生长的CR染色前去除。我们的协议大大降低了交叉污染和高度的可扩展性，使成千上万的克隆快速筛选。除了到 H jecorina酶 ，我们都表示并筛选的嗜热子囊菌斜卧青霉 （ 如图2所示）内切葡聚糖酶变种，这表明本议定书适用范围从一个生物体的酶。
Protocol
Discussion
这里所描述的协议，允许快速和高活性酶的吞吐量鉴定，用最少的操作。活动检测是相当敏感，定性地反映细胞内的活动量。它的易用性使得这种方法适合广泛的酶库，只能通过在大肠杆菌中表达功能的限制大肠杆菌 。此外，这种筛查活动并不限于真菌纤维素酶，但可适应任何内切葡聚糖酶的活性，或任何纤维素酶是一种可溶性底物（如CMC）。
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由戈登和贝蒂摩尔基金会，由UNCF /默克科学倡议。
Materials
| Reagent | Company | Product number |
|---|---|---|
| IPTG | Sigma | I1284 |
| Congo Red | Sigma | C6277 |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma | 360384 |
| NaCl | Sigma | S1679 |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 |
| Bioassay plates | Thermo Scientific | 240845 |
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