Développement d'un type de cellule spécifique anti-VIH gp120 aptamères pour la livraison de siRNA

Résumé

Plusieurs 2'-fluoro aptamères d'ARN contre le VIH-1BA-L gp120 avec nanomole affinité sont isolées à partir d'une bibliothèque d'ARN en In vitro La procédure SELEX. Un nouveau double fonction inhibitrice anti-gp120 aptamère-siRNA chimère est créé et montre prometteur pour systémiques thérapie anti-VIH.

Résumé

L'épidémie mondiale d'infection par le VIH a créé un besoin urgent de nouvelles classes d'agents antirétroviraux. La puissante capacité d'interférents (SI) des ARN pour inhiber l'expression des transcrits d'ARN complémentaires est exploitée comme une nouvelle classe d'agents thérapeutiques pour une variété de maladies dont le VIH. Beaucoup de rapports précédents ont montré que les nouvelles stratégies à base RNAi anti-VIH/SIDA thérapeutiques très prometteurs, mais un obstacle majeur à l'application réussie thérapeutiques et la traduction clinique de siRNA est une livraison efficace. En particulier, compte tenu de la sécurité et l'efficacité des traitements à base RNAi, il est hautement souhaitable de développer une approche ciblée intracellulaire livraison de siRNA à des populations spécifiques de cellules ou de tissus. Le VIH-1 protéine gp120, une glycoprotéine de l'enveloppe sur la surface du VIH-1, joue un rôle important dans l'entrée virale dans les cellules CD4. L'interaction de la gp120 et du CD4 qui déclenche le VIH-1 entrée et initie la fusion cellulaire a été validé comme cliniquement pertinente anti-viraux stratégie de découverte de médicaments.

Ici, nous avons d'abord discuter de la sélection et l'identification de la 2'-F modifiés anti-VIH gp120 aptamères d'ARN. En utilisant une méthode SELEX nitrocellulose filtre classique, plusieurs aptamères nouvelle avec une affinité nanomolaire ont été isolés à partir d'un aléatoire 50 bibliothèques nt ARN. Pour réussir à obtenir des espèces lié avec une affinité plus élevée, la rigueur de sélection est soigneusement contrôlée en ajustant les conditions. Les aptamères sélectionnés peuvent se lier spécifiquement et rapidement être internalisés dans les cellules exprimant la protéine d'enveloppe du VIH-1. De plus, les aptamères seul peut neutraliser le VIH-1 infectant. Sur la base des meilleures aptamère A-1, nous créons également un roman à double fonction inhibitrice anti-gp120 aptamère-siRNA chimère dans laquelle les deux l'aptamère et les portions siARN ont une puissante activité anti-VIH. De plus, nous utilisons la gp120 aptamère-siRNA chimères pour un type de cellule spécifique de la livraison de siRNA sur le VIH-1 des cellules infectées. Cette double fonction chimère montre un potentiel considérable pour combiner divers agents acides nucléiques thérapeutiques (aptamère et de siRNA) à supprimer l'infection VIH-1, ce qui rend les chimères aptamère-siRNA attrayants candidats thérapeutiques pour les patients en échec thérapie antirétrovirale hautement active (HAART).

Protocole

1. Préparation de la bibliothèque de l'ARN

1. La banque d'ADN de départ contient 50 nucléotides de séquences aléatoires et a été synthétisé par Integrated DNA Technologies (Cedar Rapids, Iowa). La seule séquence bloqués banque d'ADN oligo est 5'-GGG ATG AGG ACG CGG - N ₅₀ - CAG ACG ACT CCG GCC A - 3 '(81 nt). La région est flanquée par hasard régions constantes, qui comprennent le promoteur T7 pour transcription in vitro et une balise de 3 'pour la RT-PCR. Les 5 'et 3' des séquences constantes sont 5 '- TAA TAC GAC TCA CTA GCT GGA GGA CGA TGC GG - 3' (32 mer) et 5 '-TCG TCG TCT GGC GAG G - 3' (16 mer), respectivement. Faire soluti....

Discussion

Les aptamères sont des acides nucléiques in vitro évolué qui supposent spécifique et stable des formes tridimensionnelles, offrant ainsi très spécifique, obligatoire serré pour ⁸ molécules ciblées. La faible affinité nanomolaire liaison et la spécificité exquise d'aptamères à leurs cibles en font des outils polyvalents pour le diagnostic, l'imagerie in vivo, et de la thérapeutique ^9. Avec l'avènement de la technologie pour aptamère livraison de siRNA .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
MF-Millipore filtre à membrane	Millipore	HAWP01300	La taille des pores 0,45 pm
Swinnex Porte-filtre	Millipore	SX0001300	13 mm de diamètre
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28706	Purification d'ADN
Microcon YM-30 colonne	Millipore	42410	Concentration d'ARN
Bio-spin 30 colonnes	Bio-Rad	732-6250	Purification d'ARN
Taq polymérase ADN PCR	Sigma-Aldrich	D1806
ThermoScript RT-PCR	Invitrogen	11146-024
DuraScribe Kit de transcription T7	EpiCentre	DS010925
dNTP pour la PCR	Roche	1 581 295
L'acide ribonucléique, le transfert de E.coli	Sigma-Aldrich	R1753	compétiteur ARNt
VIH-1 Ba-L protéine gp120	l'AIDS Research and Référence Reagent Program	4961	Protéine cible
Kit de marquage Silencieux siARN - Cy3	Ambion	1632
Acide phénol / chloroforme 5 / 1 solution (pH 4,5)	Ambion	AM9720
Chloroforme / isopropanol 24 / 1 solution	Sigma	C0549
Phosphatase intestinale de veau (CIP)	La Nouvelle-Angleterre BioLab	M0290L
T4 polynucléotide kinase	La Nouvelle-Angleterre BioLab	M0201L
Le glycogène	Roche	10 901 393 001	ARN précipitations
Gamma-P 32-ATP	MP Biomédical	013502002	Radiactivity
40% AccuGel 19:01	Diagnostic national	CE-850
10xTBE	Diagnostic national	CE-860
N, N, N, N'-tétraméthyléthylènediamine (TMEMD)	Sigma-Aldrich	T9281
Le persulfate d'ammonium (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
L-methioine sulfoximine	Sigma-Aldrich	M5379-250 mg
RPMI 1640 avec les médias	Invitrogen	11835-030
Une solution de bicarbonate de sodium, 7,5% p / v	Invitrogen	25080-094
Minimum Essential Medium (MEM) (10 )	Invitrogen	11430-030
MEM non acides aminés essentiels (100 )	Invitrogen	11140-050
TA cloning kit avec pCR 2.1	Invitrogen	K2040-01