3 डी इमेजिंग और morphological विश्लेषण के लिए वयस्क माउस के cerebrovascular कास्टिंग
Summary
इस अनुच्छेद में, हम एक सरल, cerebrovascular ढलाई के लिए व्यावहारिक तकनीक है कि प्रदर्शन करने के लिए आसान है और वयस्क माउस मस्तिष्क के संवहनी पेड़ की छवि के लिए उपयोग किया जा सकता उपस्थित थे.
Abstract
Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.
Protocol
Discussion
हम यहाँ वयस्क माउस cerebrovasculature है कि विभिन्न तौर तरीकों के साथ imaged किया जा सकता है की कास्टिंग के लिए एक विधि रिपोर्ट. इस विधि के रोग मॉडल BAVM के लिए आवेदन अनियमित वाहिकाओं के 3 डी विश्लेषण सक्षम बनाता है. संभावित भविष्य के अध्ययन सूक्ष्म सीटी छवियों की मात्रा का ठहराव, ऊतक के histological विश्लेषण, और संवहनी रोग प्रगति के निदान शामिल हैं.
आम समस्याओं का सामना करना पड़ा और सुझाव
मस्तिष्क vasculature की पूरी छिड़काव हमेशा नहीं हासिल की है. बाएं आलिंद या महाधमनी rupturing के बिना बाहर रक्त वाहिकाओं तक पहुँचने के लिए पर्याप्त दबाव के बाद एक चुनौती है. इस पर काबू पाने के लिए, लगभग 100mmHg के अनुरूप दबाव लागू होते हैं. इसके अलावा, महाधमनी में कास्टिंग एजेंट के उपयुक्त बहिर्वाह सुनिश्चित करने के लिए सुई की स्थिति को समायोजित. यह महत्वपूर्ण है कि मन्या धमनियों ताकि कास्टिंग एजेंट मस्तिष्क वाहिकाओं तक पहुँच सकते हैं सीमित नहीं हैं. क्रिटिकल प्रक्रियाओं है कि सुधार के प्रति छोटे पोत के साथ सहसंबंधी(1) vasculature से रक्त के उचित समाशोधन, कास्टिंग एजेंट छानने का काम (2), और (3) कास्टिंग एजेंट इंजेक्शन के दौरान सुई प्लेसमेंट: संलयन हैं. ध्यान बाएं आलिंद और फेफड़ों में कास्टिंग एजेंट के इंजेक्शन से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. अन्य जांचकर्ताओं को सफलतापूर्वक अतिरिक्त प्रक्रियाओं का उपयोग कर के बिना 3 माउस और चूहा 4 cerebrovasculature perfused. Microfil perfused वाहिकाओं के मैनुअल विश्लेषण counterstained साथ hemotoxylin 93% पोत लुमेन 5 छिड़काव से पता चला है. हमेशा त्यागने या पूरी तरह से किसी भी उपकरण है कि कास्टिंग एजेंट के साथ संपर्क में आता है के रूप में यह भाजन करना जल्दी है, और उपकरण कई विषयों के लिए नहीं किया जा सकता साफ. आसपास के माउस मस्तिष्क के ऊतकों के स्पष्टीकरण चुनौतीपूर्ण हो सकता है. मिथाइल सैलिसिलेट में विसर्जन के बाद, ऊतक अभी भी अपारदर्शी दिखाई देते हैं, पोत इमेजिंग मुश्किल बना. उचित निर्जलीकरण और स्पष्टीकरण सुनिश्चित करना इस समस्या को हल करना चाहिए. एक झूली कुरसी पर शराब और मिथाइल के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों रखकरalicylate उपचार ऊतक स्पष्टीकरण में सुधार कर सकते हैं.
तकनीक की कमियां
इस तकनीक की सीमाओं में शामिल हैं: (1) यह आवश्यक है के तुरंत बाद यह मिश्रण के रूप में इसे जल्दी से और अधिक मोटा होना के बाद उत्प्रेरक जोड़ा जाता है कास्टिंग एजेंट समाधान इंजेक्षन, (2) कास्टिंग एजेंट बड़े प्रवाहकत्त्व जहाजों को आसानी से भर जाता है, लेकिन यह नहीं मज़बूती arterioles (प्रतिरोध वाहिकाओं) और capillaries (पोषक वाहिकाओं) के रूप में छोटे जहाजों को भरने, और (3) सूक्ष्म सीटी इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा radiopaque विपरीत नहीं है, हालांकि कुछ समूहों Microfil सूक्ष्म सीटी इमेजिंग 1,6 के लिए पसंद करते हैं. हालांकि, ऊपर प्रस्तावित उचित सुई प्लेसमेंट पोत स्थिति और छिड़काव दबाव सहित सुझाव, निम्नलिखित छोटे जहाजों की पूरी कास्टिंग हासिल किया जा सकता है. विभिन्न विश्लेषण उपकरणों के लिए अनुकूलन क्षमता इस धमनी और शिरापरक परिसंचरण सहित cerebrovascular संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के साथ विभिन्न एजेंट बनाता है,दृष्टिकोण.
तकनीक के आवेदन
इस विधि के लाभ के अपने व्यापक आवेदन संभावित है. डाली धमनियों, नसों, और शरीर के भीतर सभी ऊतक के capillaries सहित सभी जहाजों, भरता है, इसलिए, विभिन्न प्रजातियों के कई अंगों में संवहनी संरचनाओं का विश्लेषण किया जा सकता है. इससे पहले, अन्य समूहों के 7 बड़े और छोटे मानव, बंदर 9, 10 भेड़, 4,11,12 चूहे, और माउस 3,13 में 8 जहाजों के लिए इस छिड़काव का इस्तेमाल किया है. अब हम माउस मस्तिष्क में microvessels की संरचना के विश्लेषण में इस तकनीक का उपयोग, दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में 2 के सबूत दिखा . इसके अलावा, वहाँ विभिन्न विभिन्न अंगों में जहाजों के दृश्य में सुधार के लिए विभिन्न आकारों और विभिन्न रंगों के जहाजों छिड़कना उपलब्ध viscosities के साथ Microfil समाधान कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, लाल पीला मस्तिष्क पैरेन्काइमा में आसानी से कल्पना की है, और पीले हो सकता है के साथ अच्छी तरह से विरोधाभासोंगहरे लाल मायोकार्डियम. इसके अलावा, के रूप में सामग्री radiopaque है, vasculature सूक्ष्म सीटी के लिए एक 3 डी rotatable छवि प्राप्त स्कैनिंग के साथ imaged किया जा सकता है. ऊतक भी किया जा रहा है imaged के बाद आयल वर्गों और histological विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
निष्कर्ष
हम यहाँ एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करने के लिए वयस्क माउस मस्तिष्क, जो cerebrovasculature के morphological संरचना का अध्ययन विश्लेषण तकनीक की एक किस्म का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है की रक्त वाहिकाओं के एक संवहनी डाली. हम भी BAVM रोग राज्य के एक मॉडल के लिए इस विधि के आवेदन के लिए साक्ष्य प्रदान, बढ़े, अनियमित आकार के जहाजों द्वारा प्रतिनिधित्व है कि शिरापरक परिसंचरणों के लिए धमनी से अलग धकेलना रक्त. वहाँ संवहनी कास्टिंग उपलब्ध तरीकों की एक किस्म है. सरल प्रोटोकॉल हम एक संवहनी कलाकारों के लिए यहाँ उपलब्ध कराने के एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है वयस्क माउस मस्तिष्क के विभिन्न इमेजिंग रूपात्मकता का उपयोग vasculature की जांच.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों पांडुलिपि तैयारी के साथ सहायता के लिए वॉल्टेअर Gungab धन्यवाद. इस काम के हिस्से में से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (T32 GM008440 EJ वाकर, R01 WL युवा करने के लिए NS27713, P01 WL युवा और एच. र NS44155), एच. र और NS070153 R21, और अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन (अहा एच. र के लिए 10GRNT3130004).
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Notes |
| Microfil | FlowTech, Inc. | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
References
- Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs. Bone. 43, 195-202 (2008).
- Walker, E. J. Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease. Ann. Neurol. , (2011).
- Iqbal, U. Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours. Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).
- Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat. 145, 473-480 (2003).
- Chugh, B. P. Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography. Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. a. i. n. e. y., L, L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).
- Fossett, D. T., Caputy, A. J. . Operative Neurosurgical Anatomy. , (2002).
- Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta). Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).
- Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).
- Brady, J. M., Cutright, D. E. A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat. Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).
- Evan, A. P., Dail, W. G. Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney. Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
