Testa protein-protein interaktion är nödvändig för dissekering av proteiner fungerar. Här presenterar vi ett<em> In vitro</em> Protein-proteinbindning analys för att undersöka ett membran-immobiliserade protein med ett lösligt protein. Denna analys ger en tillförlitlig metod för att testa samspelet mellan ett olösligt protein och ett protein i lösning.
Validering av interaktioner mellan olika proteiner är avgörande för undersökning av deras biologiska funktioner på molekylär nivå. Det finns flera metoder, både in vitro och in vivo, för att utvärdera proteinbindning, och åtminstone två metoder som kompletterar bristerna i varandra bör genomföras för att få tillförlitliga insikter.
För en in vivo, representerar bimolecular fluorescens komplettering (BiFC assay) de mest populära och minst invasiva metoden som gör det möjligt att upptäcka protein-protein växelverkan i levande celler, samt identifiera de intracellulära lokaliseringen av de interagerande proteiner 1,2. I denna analys, är icke-fluorescerande N-och C-terminal halvor av GFP eller dess varianter smält att testas proteiner, och när de två fusionsproteiner förs samman på grund av de testade proteiner "interaktion är fluorescerande signal färdigberedda 3-6 . Eftersom dess signal är lätt upptäckas med epifluorescence eller konfokalmikroskopi har BiFC framträtt som ett kraftfullt verktyg att välja bland cell biologer för att studera om protein-protein interaktioner i levande celler 3. Denna analys kan dock ibland ge falskt positiva resultat. Till exempel kan den fluorescerande signalen beredas av två GFP fragment ordnas så långt som 7 nm från varandra på grund av nära packning i en liten subcellulära fack, utan att på grund av specifika interaktioner 7.
På grund av dessa begränsningar bör de resultat som erhållits från levande teknik cell imaging bekräftas av en oberoende strategi som bygger på en annan princip för att upptäcka proteininteraktioner. Co-immunoprecipitation (Co-IP) eller glutationtransferas (GST) pull-down-analyser representerar sådana alternativa metoder som allmänt används för att analysera protein-protein interaktioner in vitro. Men Beräkningsgrund för skatt dessa analyser måste dock de testade proteiner vara lättlöslig i den buffert som supportsused för bindande reaktion. Därför kan inga specifika interaktioner mellan ett olösligt protein inte bedömas av dessa tekniker.
Här visar vi protokollet för det protein membran overlay bindande analys, som kringgår denna svårighet. Med denna teknik kan interaktion mellan lösliga och olösliga proteiner på ett tillförlitligt sätt testas eftersom ett av de proteiner som är immobiliserade på ett membran matris. Denna metod i kombination med in vivo-experiment, som BiFC, ger en tillförlitlig metod för att undersöka och karakterisera interaktioner troget mellan lösliga och olösliga proteiner. I denna artikel bindande mellan tobak viruset (TMV) rörelse protein (MP), som utövar flera funktioner under virala cell till cell transporter 8-14, och ett nyligen identifierat anläggning cellulära Interactor, tobak ankyrin upprepa innehåller protein (ANK ) 15, påvisas med denna teknik.
Detta tillvägagångssätt är lämpligt för testning protein-protein interaktioner mellan kombinationer av proteiner, när minst en av dessa proteiner är lätt löses upp i bindande buffert och framgångsrikt tillämpats på annan kombination av proteiner 17,18. Den iInteractions mellan de proteiner som är både olösliga under dessa förhållanden kan inte testas av detta protokoll.
Dessutom lyckas vika av ProIM kritiska för analysen. Sköljning membranet i TBS efter electro…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i vårt laboratorium stöds av anslag från NIH, USDA National Institute of livsmedel och jordbruk, NSF, Bard, DOE, och BSF till VC
Name of the reagent | Company | Catalog number |
Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
Anti-strepII | GenScript | A00626 |
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |