우리는 함께 orthodontic 가전 제품에서 자연 구두 biofilm의 구조와 작곡 분석을 위해 프로토콜을 제시<em> 현장에서</em> 하이브 리다이 제이션 (물고기) 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM). 구강 biofilm 샘플들은 표면에 묻은 아크릴 – 수지 조각 근근이 살아가고와 분자 처리를 위해 그들을 추천, 맛이 좋은 확장기에서 수집되었다.
자연 이기종 biofilm의 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)은 얼룩 기법, 그들이 원위치 하이브리드화 (물고기)에서 형광되는 하나의 포괄적인 범위로 오늘날 용이합니다. 1,2, 우리는 구강 biofilm 예제는 고정에서 수집하는 파일럿 연구를 수행 orthodontic 가전 (맛이 좋은 확장기)는 생선, 자연 biofilm 및 상패 축적의 3 차원의 조직을 평가하는 목적에 의해 스테인드되었습니다. 3,4 물고기가 찬란 레이블 16를 사용하여 네이티브 biofilm 환경에서 세포를 얼룩 수있는 기회를 만듭니다 rRNA 타겟팅 프로브를. 4-7,19이 immunofluorescent 라벨과 같은 다른 기술에 비해,이 혼합 biofilm의 컨소시엄에서 다른 박테리아 그룹을 조사 저렴, 정확하고 간단 라벨 기법입니다. 18,20 일반 프로브가 사용하는 것을 Eubacteria에 바인딩 ( EUB338 + EUB338II + EUB338III; 이하 EUBmix), 80-10 Firmicutes는 (LGC354 AC;. 이하 LGCmix), 9,10과 Bacteroidetes (Bac303) 11 또한, 연쇄상 구균의 mutans에 바인딩을 특정 프로브 (MUT590) 12,13과 Porphyromonas gingivalis의 (POGI) 13,14 사용되었습니다 . 관련 표면 재료의 극단적인 경도 (스테인레스 스틸과 아크릴 수지)는 biofilm을 준비하는 새로운 방법을 찾는 우리에게 강요. 이러한 표면 물질이 쉽게 cryotome로 잘라 수 없습니다로서, 다양한 샘플링 방법은 그대로 구두 biofilm을 얻기 위해 탐험했다. 이러한 방식을 가장 가능한이 의사 소통에 표시됩니다. biofilm 운반 아크릴 수지의 작은 조각은 biofilm 구조를 손상하지 않도록 돌봐, 무균 메스로 긁어 냈했다. 집게는 철강 표면의 biofilm를 수집하는 데 사용되었습니다. 일단 수집, 샘플은 고정 및 polysine 코팅 유리 슬라이드에 직접 배치했다. 물고기가 프로브 m 이러한 슬라이드에서 직접 수행되었습니다위 entioned. 다양한 생선 프로토콜 결합하여 취급하기가 쉽고 새로운 프로토콜을 만들 수정되었습니다. 5,10,14,15은 이후 샘플을 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 분석되었다. 잘 알려진 구성 3,4,16,17는 버섯 스타일의 형성 및 채널에 의해 줄다리기 coccoid 박테리아의 클러스터를 포함하여, 시각 수 있습니다. 또한, 이러한 전형적인 biofilm 구조의 세균성 조성 분석과 2D 및 3D 이미지는 만들어졌습니다.
설명한 프로토콜 계약은 하드 자료의 수집 얼룩 biofilms에 매우 가능한 접근이다. 샘플링과 하이브 리다이 제이션은 가장 중요한 단계입니다. 샘플링 기간 동안주의가 충분한 두께의 조각이 biofilm 구조가 그대로 유지하기 위해 수집되는 이동해야합니다. 하이브 리다이 제이션 동안, 그것은 따라서 찬란 분류 프로브가 아닌 특정 바인딩 또는 바인딩의 손실을 피하고, 온도 과도한 변동을 피하기 위해 필수적입니다. 이 물고기 프로토콜의 구성을 방해하지 않고 직접 유리 슬라이드에 정상적인 이기종 biofilm을 얼룩이 우아한 방법입니다. 슬라이드 바로 다시 샘플을 이동하지 않고 현미경을 위해 사용될 수 있습니다. 이러한 방식으로, 튜브에 얼룩 이상의 개선이 biofilm에 적용되는 더 적은 전단 강제로 이루어집니다. > 50 μm의 두께의 조각이 방식으로 준비하고 조사 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 의과 대학 그라츠의 위생 Fonds에 의해 지원되었다. 모든 과목들은 정보에 동의했다. 연구 프로토콜의 기관 승인 의과 대학 그라츠로부터 얻은 것입니다.
Oligonucleotides | Target organism | Fluorochrome |
---|---|---|
EUB338 – 338III | Eubacteria | Cy3 |
LGC354 A-C | Firmicutes | FITC |
Bac303 | Bacteroidetes | Cy5 |
Mut590 | Streptococcus mutans | FITC |
POGI | Porphyromonas gingivalis | FITC |
Table 3. Oligonucleotides (refer to probeBase13 for details).
Component | Company | Comments |
---|---|---|
4% paraformaldehyde | 4% solution in PBS | |
1 x PBS | 3 x solution prepared | |
ddH2O | Millipore | |
Ethanol (100%) | Merck | |
Lysozyme | Roth | 100 mg/ml stock solution |
Formamide | Roth | 99.5% solution |
5 M NaCl | Roth | |
1 M Tris-HCl | Roth | |
2% SDS | Roth | |
FISH probes (oligonucleotides) | Invitrogen, Sigma | |
ProLong Gold antifadent | Invitrogen | |
Nail polish | ||
Equipment | ||
Incubator | Thermo Scientific | |
Water bath | IKA Tez | |
50 ml tubes | Sarstedt | |
Polysine-coated slides | Thermo Scientific |
Table 4. Materials and equipment.