Vi presenterar ett protokoll för strukturella och analysen av sammansättningen av naturliga orala biofilmen från tandställningar med<em> På plats</em> Hybridisering (FISH) och konfokala laserskanning mikroskopi (CLSM). Muntlig biofilm togs från palatinala expansionsturbiner skrapa akryl-harts flingor av deras yta och hänvisa dem för molekylär behandling.
Konfokala laserskanning mikroskopi (CLSM) av naturliga heterogena biofilm idag underlättas av ett omfattande sortiment av färgningsteknik, en av dem är fluorescens in situ hybridisering (FISH). 1,2 Vi har genomfört en pilotstudie där orala biofilmen prover som tagits från fasta tandställningar (palatinala expansionsturbiner) färgades av fiskar, eftersom målet är att bedöma den tredimensionella organisationen av naturliga biofilm och plack ackumulering. 3,4 FISK skapar en möjlighet att färga cellerna i sitt ursprungliga biofilmen miljön genom användning av fluorescerande 16S rRNA-targeting sonder. 4-7,19 jämfört med alternativa tekniker som immunofluorescens märkning, detta är ett billigt, exakt och enkel märkning teknik för att undersöka olika bakteriella grupper i blandade biofilmen konsortium. 18,20 Allmänna sonder användes som binder till eubakterier ( EUB338 + EUB338II + EUB338III; nedan EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. Fanns nedan LGCmix), 9,10 och Bacteroidetes (Bac303) 11 Dessutom specifika prober bindning till Streptococcus mutans (MUT590) 12,13 och Porphyromonas gingivalis (postgiroinstitutet) 13,14 användas . Den extrema hårdheten hos de inblandade ytan material (rostfritt stål och akrylharts) tvingade oss att hitta nya sätt att förbereda biofilm. Eftersom dessa ytmaterial inte kunde lätt skäras med en cryotome var olika provtagningsmetoder utforskas för att få intakta oral biofilm. Den mest användbara av dessa synsätt presenteras i detta meddelande. Små flingor av biofilmen som bär akrylharts var skrapas bort med en steril skalpell och var noga med att inte skada biofilm struktur. Tång har använts för att samla biofilm från stålytor. När samlas in, var de prover fast och placeras direkt på polysine belagt glas diabilder. FISH utfördes direkt på de här bilderna med sonder mentioned ovan. Olika FISH protokoll slogs ihop och modifieras för att skapa ett nytt protokoll som var lätt att hantera. 5,10,14,15 Därefter proverna analyserades med konfokala laserskanning mikroskopi. Välkända konfigurationer 3,4,16,17 kan visualiseras, inklusive svamp-stil formationer och kluster av kockoida bakterier genomsyras av kanaler. Dessutom var den bakteriella sammansättningen av dessa typiska biofilm strukturer analyseras och 2D-och 3D-bilder skapas.
Protokollet beskrivs nedan är en mycket användbar metod för färgning biofilmer samlas in från hårda material. Provtagning och hybridisering är de mest kritiska stegen. Under provtagningen måste man se till att skivor av tillräcklig tjocklek samlas för att säkerställa att biofilmen strukturen är intakt. Under hybridisering, är det viktigt att undvika alltför stora variationer i temperatur, för att undvika icke-specifik bindning, eller förlust av bindande för fluorescerande prober. Denna fisk-protokollet är en elegant metod att färga normala heterogena biofilm direkt på glaset glider utan att störa dess sammansättning. Bilderna kan omedelbart användas för mikroskopi utan att behöva flytta provet igen. På detta sätt är en förbättring jämfört färgning i rören uppnås genom mindre skärkraft tillämpas på biofilmen. Slices> 50 ìm tjocka kan förberedas och utredas på detta sätt.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av hygien Fonds av Medical University Graz. Alla försökspersoner gav sitt informerade samtycke. Institutionella godkännande av studien protokollet erhölls från Medical University Graz.
Oligonucleotides | Target organism | Fluorochrome |
---|---|---|
EUB338 – 338III | Eubacteria | Cy3 |
LGC354 A-C | Firmicutes | FITC |
Bac303 | Bacteroidetes | Cy5 |
Mut590 | Streptococcus mutans | FITC |
POGI | Porphyromonas gingivalis | FITC |
Table 3. Oligonucleotides (refer to probeBase13 for details).
Component | Company | Comments |
---|---|---|
4% paraformaldehyde | 4% solution in PBS | |
1 x PBS | 3 x solution prepared | |
ddH2O | Millipore | |
Ethanol (100%) | Merck | |
Lysozyme | Roth | 100 mg/ml stock solution |
Formamide | Roth | 99.5% solution |
5 M NaCl | Roth | |
1 M Tris-HCl | Roth | |
2% SDS | Roth | |
FISH probes (oligonucleotides) | Invitrogen, Sigma | |
ProLong Gold antifadent | Invitrogen | |
Nail polish | ||
Equipment | ||
Incubator | Thermo Scientific | |
Water bath | IKA Tez | |
50 ml tubes | Sarstedt | |
Polysine-coated slides | Thermo Scientific |
Table 4. Materials and equipment.