Een high-throughput, geautomatiseerd platform van de productie cellijn ontwikkeling voor de productie van therapeutische eiwitten is beschreven. Uitvoering van de BD FACS Aria Cell Sorter, heeft CloneSelect Imager en Tecan Freedom EVO liquid handling systeem gedemonstreerd aanzienlijk toegenomen verwerkingscapaciteit in cellijn ontwikkeling met verbeterde cellijn kwaliteit en een hoge reproduceerbaarheid.
De snel groeiende biofarmaceutische industrie vraagt om een snelle ontwikkeling van zeer efficiënte en betrouwbare productie-systemen om te voldoen aan de toenemende behoefte aan drugs benodigdheden. De generatie van de productie-cellijnen is van oudsher betrokken handmatige handelingen die zijn arbeidsintensief, laag-doorvoer en kwetsbaar voor menselijke fouten. Wij rapporteren hier een geïntegreerde high-throughput en geautomatiseerde platform voor de ontwikkeling van de productie cellijnen voor de productie van therapeutische eiwitten.
De combinatie van de BD FACS Aria ™ Cell Sorter, CloneSelect ™ Imager en Tecan Freedom EVO ® liquid handling-systeem heeft het mogelijk gemaakt een high-throughput en efficiënter cellijn ontwikkelingsproces. In deze operatie worden de productie gastheer cellen eerst getransfecteerd met een expressievector die het gen van belang een, gevolgd door de behandeling met een selectie agent. De stabiel-getransfecteerde cellen worden vervolgens gekleurd met fluorescentie-gelabeld anti-humaan IgG-antilichaam, en worden vervolgens onderworpen aan flowcytometrie-analyse 2-4. Zeer productief cellen worden geselecteerd op basis van fluorescentie-intensiteit en worden geïsoleerd door single-cell sorteren op een BD FACSAria ™. Kolonie de vorming van een-cellig stadium werd microscopisch gedetecteerd en een reeks van tijd-ronden digitale beelden worden genomen door CloneSelect ™ Imager voor de documentatie van de cellijn geschiedenis. Na een enkele klonen hebben gevormd, werden deze klonen gescreend op de productiviteit door ELISA uitgevoerd op een Tecan Freedom EVO ® liquid handling systeem. Ongeveer 2.000 – 10.000 klonen kunnen worden gescreend per bedrijf cyclus met het huidige systeem setup.
Deze geïntegreerde aanpak is gebruikt om een hoge productie van Chinese hamster ovarium (CHO) cel-lijnen voor de productie van therapeutische monoklonale antilichaam (mAb) evenals hun fusie-eiwitten te genereren. Met behulp van verschillende soorten opsporen van sondes, kan de methode worden gebruikt voor het ontwikkelen van andere therapeutische eiwitten of worden toegepast op andere productie-host-systemen. In vergelijking met de traditionele handmatige procedure, deze geautomatiseerde platform aangetoond voordelen van een aanzienlijk verhoogde capaciteit, verzekerd klonaliteit, traceerbaarheid in cellijn geschiedenis met elektronische documentatie en veel lagere kans in een bedieningsfout.
Wij presenteerden een geautomatiseerde productie cellijn ontwikkelplatform dat isolatie van zeer productieve klonen mogelijk maakt, en in de tussentijd, terwijl zorgt klonaliteit en kloon stabiliteit. De betrokkenheid van de oppervlakte antilichaam kleuring gevolgd door FACSAria ™ celsortering is de sleutel tot het verkrijgen van enkele klonen met een hoge antilichaam productiviteit. Onze resultaten en andere rapporten 2-4 suggereren dat het antilichaam niveau tijdelijk wordt weergegeven op het celoppervlak goed gecorreleerd met de productiviteit van de cel. Zo kan een fluoresceïne-geconjugeerd antilichaam gebruikt worden om het membraan bijbehorende product te herkennen en de isolatie van hoge producenten hulp. Als alternatief zijn co-expressie van reportergenen en gel MicroDrop technologie is gebruikt om de selectie van hoog-producerende klonen te vergemakkelijken door FACS 6-8. Naast het isoleren van hoge productie van klonen via FACS, hebben andere technologieën ontwikkeld om hetzelfde doel te bereiken. Deze omvatten Trellis bio-CellSpot technologie die microspere antilichaam detectie systemen en laser screening technologie gebruikt om zeer productieve klonen te identificeren en ongewenste cellen, Genetix ClonePix FL en StemCell Technologies ClonaCell EasyPick platform dat high throughput screening van de productie-cellijnen met behulp van een fluorescerende antistof detectie systeem uit te voeren te elimineren . We hebben ervoor gekozen om de FACS klonen methode gebaseerd op oppervlakte geassocieerd antilichaam niveau uit te voeren want het combineert het gemak van de werking, selectiviteit op productiviteit en klonaliteit.
De inzet van Tecan Freedom EVO ® liquid handling systeem aanzienlijk toegenomen screening doorvoersnelheid, die de mogelijkheid om te selecteren op high yield klonen van een veel grotere cel zwembad bieden. Andere instrumentatie voor test zoals HTRF, Bioforte Octet, HPLC, etc, worden alle mogelijke middelen te selecteren hoge producenten en uitselecteren van een lage producenten. Door het bijhouden kloon formatie met CloneSelect Imager ™ genereerden wij nodige documentatie om klonaliteit met gedigitaliseerde cellijn de geschiedenis te bewijzen. Klonaliteit wordt verder bevestigd door genetisch enkele transgene integratie plaats karakteriseren op het chromosoom. Een subkloning stap, die meestal wordt genomen om de klonaliteit te waarborgen, kunnen dus worden geëlimineerd. Dit bespaart 4-8 weken de tijd voor cellijn ontwikkeling. Kortom, de kwaliteit van cellijnen gegenereerd door de high-throughput geautomatiseerd platform toonde een hoge productiviteit, de productie stabiliteit en gedocumenteerd cellijn de geschiedenis dat de vraag naar grootschalige productie en de huidige wettelijke eisen moeten voldoen.
The authors have nothing to disclose.
Name | Company |
BD FACS Aria™ Cell Sorter | BD Bioscience |
CloneSelect™ Imager | Genetix |
TECAN Freedom EVO® liquid handling system | Tecan Group |