Isolering af Funktionel Cardiac immunceller

Summary

Denne metode til at isolere funktionel immunceller fra hjertet giver et alternativ til de konventionelle metoder collagenase fordøjelse, der forårsager uønsket immun celle aktivering, hvilket resulterer i en nedsat reaktionsevne af disse celler. Vores metode til isolation giver funktionelle hjertets immunceller ved at undgå problemer i forbindelse med enzymatisk fordøjelse.

Abstract

Cardiac immunceller er stigende interesse for de roller, de spiller i den patologiske remodeling i mange hjertesygdomme ^1-5 Disse immunceller, som omfatter mast celler, T-celler og makrofager;. Opbevare og frigive en række af biologisk aktive mediatorer, herunder cytokiner og proteaser, såsom tryptase. ^6-8 Disse mæglere har vist sig at være centrale aktører i ekstracellulære matrix stofskifte ved at aktivere matrixmetalloproteinaser eller forårsager kollagen ophobning ved at modulere hjertefunktionen fibroblaster 'funktionen. ^9-11 dog tilgængelige teknik til at isolere hjerte immunceller har været problematisk, fordi de bruger bakteriel collagenase at fordøje myokardiets væv. Denne teknik medfører aktivering af immunceller og dermed et tab af funktion. For eksempel bliver hjertets mastceller betydeligt mindre lydhøre over for stoffer, der forårsager degranulering. ¹² Derfor har vi udviklet en teknik, der giver mulighed for than isolering af funktionelle hjerte immunceller, som ville føre til en bedre forståelse af den rolle, disse celler i hjertesygdom. ^{13, 14}

Denne metode kræver et kendskab til de anatomiske placering af rottens formet som et sværd proces, armhulen og falciform ligament, og hjertesækken af ​​hjertet. Disse milepæle er vigtigt at øge succesen af ​​proceduren og for at sikre et højere udbytte af hjertets immunceller. Disse isolerede hjerte immunceller kan derefter bruges til karakterisering af funktionalitet, fænotype, modenhed, og co-kultur eksperimenter med andre hjerteceller at få en bedre forståelse af deres samspil.

Protocol

1. Udarbejdelse af Hanks 'Balance Salt Solution (HBSS) Autoklave 1 L glas bægerglas, dimitteret 1000 mL cylinder, og rør bar. Opløs HBSS pulveret løsning i autoklaveres 1 L glas bægerglas til 900 mL mærket med dobbeltdestilleret vand. Bland HBSS løsning med 3,4 g HEPES Na + salt og pH indstilles til en værdi mellem 7,35-7,41 enten ved hjælp af koncentreret HCl eller NaOH. Når den ønskede pH-værdien er nået, og forbliver stabil, tilsættes 5 g af bovin serum album…

Discussion

Denne metode til at isolere hjerte immunceller muliggør en analyse af deres funktion, fænotype, og modenhed uden uønskede aktivering, der typisk opstår under en traditionel enzymatisk fordøjelse isolation teknik. Den gennemsnitlige samlede antal celler, der opnås med denne teknik er omkring 400.000 per rotte hjerte, og forskellen farvning og flowcytometri analyse af disse celler indikerer blandet befolkning af T-lymfocytter (~ 70%), makrofager (~ 12%) og mast celler med brugen af denne teknik. (~ 12%). ^{13, 14…}

Materials

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	Gibco	15240-062
HEPES	Sigma	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermoscientific	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Products	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE Incorporated	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483